麦角甾醇与吉非替尼联合用药协同抑制非小细胞肺癌A549和PC-9细胞增殖

米完完，黄 挺，张梦迪，黄绳武

（1.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 311402；2.杭州红十字会医院普外科，浙江 杭州 310003）

由于癌症发病率和死亡率的持续增高，目前仍然是世界上重要的公共卫生问题。在2018年，我国共有430万新发肿瘤病例和290万癌症死亡病例，肺癌发病率最高，且死亡率也排在各种不同肿瘤类型疾病之首[1]。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占85%[2]，传统的放、化疗效果一直不理想，缓解率仅约30%，大多数患者就诊时，往往已处于中晚期，错过了手术治疗的最佳时期。

吉非替尼（gefitinib，GEF）是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，一线治疗EGFR突变的晚期NSCLC[3-4]。其作用机制主要通过与ATP竞争和EGFR的结合，通过丝氨酸苏氨酸激酶（serine-threonine kinase，Akt）信号通路等途径阻断EGFR信号传导通路，抑制自身磷酸化以及活化，阻断表达EGFR的肿瘤细胞生长，阻断磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt等下游信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，起到抗肿瘤作用[5-7]。然而，即使是GEF治疗有效者，多数患者在治疗后10～14个月后都会发生不同程度的耐药现象，最终将导致药物疗效降低[8-10]。2018年底，国家对进口药GEF实行零关税，并被纳入医保行列，此举使GEF在NSCLC患者中广泛使用。但面临的问题是GEF耐药出现的频率大幅度增加。因此，增加GEF对肺癌细胞的敏感性，减小GEF使用剂量，预防与克服GEF的耐药性显得尤为迫切。

本实验室前期采用真菌牛樟芝开展体外抗肿瘤作用研究，筛选出其中的麦角甾醇（ergosterol，ERG）成分对肺腺癌A549细胞具有较好的细胞增殖抑制作用。同时实验室发现ERG和顺铂联用在A549细胞上具有较好的促进细胞凋亡的作用。在体外研究的基础上，实验室开发了ERG联合顺铂主动靶向双载药脂质体递药系统[11-13]，体内外实验证实了其具有较好的靶向抗肺癌作用。

本研究采用2种细胞系（分别对GEF敏感的PC-9细胞和耐药的A549细胞）进行ERG对肿瘤细胞的抑制作用研究。探讨ERG与GEF联用是否具有协同抗肺癌的作用，能否针对敏感细胞株达到增效效果，能否增加耐药细胞株的敏感性，以及初步探讨其作用机制，为进一步研究体内抗肿瘤活性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

人肺癌A549细胞（中国科学院生命科学研究院细胞库），人肺癌细胞PC-9（上海名劲生物科技有限公司）。GEF原料药（南京安格医药化工有限公司，批号：170301）；ERG原料药（批号：BCBN4049V），二甲基亚砜（批号：WXBB8079V）（美国Sigma公司）；MTT（批号：B0016K012500），0.22 μm PVDF 膜（美国Biosharp公司）；0.25%胰蛋白酶（杭州诺森德生物技术有限公司，批号：ZL101818）；优级胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（澳洲Gemini公司，批号：A37F00H）；RPMI 1640（美国Gibco公司，批号：8118009）；青-链霉素溶液（批号：170907-0503）、Hoechst 33258凋亡染色试剂盒、PMSF（100 mmol·L-1，批号：090117171114）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型，批号：071417171026）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（批号：051017170702）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（批号：111517171113）（上海碧云天生物技术有限公司）；Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（批号：7235944）、PI/RNase染色液（批号：7166582）（美国BD公司）；0.22 μm PVDF膜（美国Biosharp公司）；β肌动蛋白、EGFR、Akt小鼠抗单克隆抗体，p-Akt、p-EGFR兔多克隆抗体（美国ImmunoWay Biotechnology公司）；山羊抗小鼠荧光二抗，山羊抗兔荧光二抗（美国LI-COR公司）1300 SERIES A2生物安全柜（美国赛默飞世尔公司）；ECLIPSE TS100/100-F倒置生物显微镜（日本尼康公司）；Invitrogen EVOS FL细胞成像工作站、Thermo 3111型CO2培养箱，Thermo 905超低温冰箱（美国赛默飞世尔公司）；Eppendorf 5427R台式高速冷冻离心机、Eppendorf 5702台式离心机、微量移液枪（德国Eppendorf公司）；SX-500高压灭菌锅（日本TOMY公司）；Cryosystem 750液氮罐（美国MVE公司）；SynErgosteroly H1MFD多功能酶标仪（美国BioTek公司）；guava easyCyte 6HT-2L微流式细胞分析仪（美国默克公司）；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司）；Odyssey Clx双色红外激光成像系统（美国LI-COR公司）。

1.2 MTT法检测细胞存活

调整对数生长期A549/PC-9细胞悬液浓度为5×107L-1。100×g离心5 min后，吹打混匀成单细胞悬液，每孔加100 μL于96孔培养板，于37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞融合80%后加药处理。其中各个给药组加100 μL不同浓度不含FBS的药物溶液，正常对照组加100 μL不含FBS培养液。每浓度各设5复孔，分别于加药后第24，48和72 h后进行MTT检测。每孔加MTT 5 g·L-1溶液20 μL，37℃孵育4 h后，采用酶标仪于492 nm处测定各孔吸光度值（A492nm），在570 nm处验证。计算各组各浓度下的抑制率（IR），采用q值判断ERG和GEF联用的性质。本实验重复3次进行。IR（%）=（对照组A492nm-实验组A492nm）/对照组A492nm×100%。q=EAB（/EA+EB-EA×EB）。

式中EA和EB为各药单用IR，EAB为两药合用IR。q＞1.15为协同作用，0.85～1.15为相加作用，＜0.85为拮抗作用。

1.3 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡

取对数生长期A549非小细胞肺癌细胞，实验分为 4 组：对照组、ERG 20 μmol·L-1、GEF 20 μmol·L-1和 ERG+GEF（20+20）μmol·L-1。调整对数生长期A549细胞悬液密度为1.5×108L-1。100×g离心5 min后，吹打混匀成单细胞悬液，每孔加2 mL含药培养基于6孔培养板，每药3复孔。于37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞融合80%后加药处理。48 h后PBS清洗3次，加4%多聚甲醛室温固定20 min。吸出4%的多聚甲醛后用PBS小心清洗3次，加Hoechst 33258染液，37℃染色30 min。弃染色液后用PBS清洗3次，于荧光显微镜下观察细胞核形态。本实验重复3次进行。

取对数生长期PC-9非小细胞肺癌细胞，实验分为4组：对照组、ERG 40 μmol·L-1、GEF 5 μmol·L-1和 ERG+GEF（40+5）μmol·L-1，细胞悬液密度为2×108L-1，其他操作同上。

1.4 流式细胞术测定细胞凋亡率

采用AnnexinⅤ-PI双染流式细胞术检测各组凋亡情况。将对数生长期的A549细胞调整密度为1.5×108L-1。100×g离心5 min后，吹打混匀成单细胞悬液，每孔加2 mL给药培养基于6孔培养板，设置每个药每浓度3复孔，ERG（10，20，40）μmol·L-1，GEF（10，20，40）μmol·L-1，ERG+GEF（10+10，20+20，40+40）μmol·L-1。于37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞融合80%后加药处理48 h后收集上清及细胞，PBS洗涤3次，100×g离心5 min，用100 μL 1×流式缓冲液重悬，每个给药孔加 5 μL FITC与5 μL PI荧光染料，于室温下黑暗处孵育15 min后，每孔继续加400 μL 1×缓冲液，用涡旋混合器低转速下混合均匀，过400目筛网后，1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

取对数生长期PC-9细胞，设每药每浓度3复孔，ERG（20，40，80）μmol·L-1，GEF（2.5，5，10）μmol·L-1，ERG+GEF（20+2.5，40+5，80+10）μmol·L-1。其他操作同上。

1.5 流式细胞术测定细胞周期

将对数生长期的A549细胞调整为1.5×108L-1，接种于6孔培养板内，于37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞融合80%后加药处理，设ERG 40 μmol·L-1组、GEF 40 μmol·L-1组和 ERG+GEF（40+40）μmol·L-1组。药物作用48 h后，收集上清及细胞，100×g离心10 min，PBS洗涤1次后，用75%冰乙醇固定过夜，离心弃乙醇，用PBS洗涤2次。弃PBS，每个样本加0.5 mL PI染色液室温避光染色15 min，置流式细胞仪上测定各周期细胞比例。本实验重复3次。

取对数生长期PC-9细胞，设ERG 40 μmol·L-1、GEF 5 μmol·L-1和ERG+GEF（40+5）μmol·L-1，每浓度3复孔。其他操作同上。

1.6 Western 印迹法检测 Akt，p-Akt，EGFR 和p-EGFR蛋白表达

将对数生长期的A549/PC-9细胞密度调整为2×108L-1接种于6孔培养板内，A549细胞分别设GEF 20 μmol·L-1、ERG 20 μmol·L-1、ERG+GEF（20+20）μmol·L-1组和对照组，PC-9细胞分别设GEF 5 μmol·L-1、ERG 40 μmol·L-1、ERG+GEF（40+5）μmol·L-1组和对照组加药处理48 h后提取细胞总蛋白，并用BCA试剂盒测定其浓度。调整各组总蛋白浓度相同后将蛋白质样品与5×上样缓冲液混合后于100℃中煮沸5 min，加相应浓度的SDS-PAGE胶中电泳至溴酚蓝距离胶底部1 cm处即停止电泳，然后转至0.22 μm PVDF膜上，Western封闭液封闭1 h，稍洗后分别加适量一抗Akt（1∶1000），p-Akt（1∶500），EGFR（1∶1000），p-EGFR（1∶500），β肌动蛋白（1∶4000）于4℃下孵育过夜，Western洗涤液漂洗3次，每次5 min，加对应来源的荧光二抗常温孵育2 h，Western洗涤液洗膜3次，每次5 min，采用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫膜，采用Image J软件对蛋白印迹条带进行积分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。待测蛋白相对表达水平用目标蛋白IA值和β肌动蛋白蛋白IA之比表示。本实验重复3次。

1.7 统计学分析

实验结果数据均用±s表示，实验重复3次。采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，采用单因素方差分析法，两组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麦角甾醇与吉非替尼联合用药对人肺癌A549和PC-9细胞的增殖抑制作用

人肺癌A549细胞增殖抑制实验结果（图1）显示，在 24，48 和 72 h，GEF 5～160 μmol·L-1和ERG 5～160 μmol·L-1均能抑制A549细胞的生长，且呈浓度依赖性（ERG：r=0.898，r=0.924，r=0.935；GEF：r=0.988，r=0.884，r=0.793）。与ERG和GEF单药各浓度组相比，两药联用相应浓度组对A549细胞的增殖抑制率提高（P＜0.01）。作用24和48 h时，ERG+GEF联用浓度分别为（5+5）μmol·L-1，（10+10）μmol·L-1，（20+20）μmol·L-1时，两药联用具有协同作用；作用72 h时，两药联用ERG+GEF（5+5）μmol·L-1具有协同作用。ERG+GEF（20+20）μmol·L-1是两药具有协同作用的最大浓度，浓度加大，两药仅仅只有相加作用（图1D）。因此，后续 A549 细胞实验以 ERG 20 μmol·L-1和 GEF 20 μmol·L-1作为中间浓度进行。

人肺癌PC-9细胞增殖抑制实验结果（图2）显示，在24，48和72 h时，GEF 0.625～20 μmol·L-1和ERG 5～160 μmol·L-1均能抑制PC-9 细胞的生长，该抑制作用呈浓度依赖性（ERG：r=0.925，r=0.978，r=0.869；GEF：r=0.872，r=0.859，r=1.0）。与各单用药组相比，ERG+GEF联用各组PC-9细胞的增殖抑制率均提高（P＜0.01）。作用24 h与48 h时，ERG和GEF联用浓度分别为（5+0.625）μmol·L-1，（10+1.25）μmol·L-1，（20+2.5）μmol·L-1，（40+5）μmol·L-1时，两药联用具有协同作用，ERG+GEF（40+5）μmol·L-1时具有协同作用的最大浓度，浓度加大，两药仅仅只有相加作用（图2D）。因此，后续PC-9细胞实验以ERG+GEF（40+5）μmol·L-1作为中间浓度进行。

Fig.1 Effect of ergosterol（ERG）combined with gefitinib（GEF）on proliferation of A549 cells and their synergy index.Human lung cancer cells A549 were treated with ERG 5-160 μmol·L-1（A），GEF 5-160 μmol·L-1（B）or ERG+GEF combination（C）for 24，48 or 72 h，respectively.D：synergy index of ERG+GEF combination at 24，48 or 72 h.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with corresponding concentration of GEF group；##P＜0.01，compared with corresponding concentration of ERG group.

Fig.2 Effect of ERG combined with GEF on proliferation of PC-9 cells and their synergy index.PC-9 cells were treated with ERG 0.625-20 μmol·L-1（A），GEF 5-160 μmol·L-1（B）or ERG+GEF combination（C）for 24，48 or 72 h，respectively.D：synergy index of ERG+GEF combination at 24，48 or 72 h.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with corresponding concentration of GEF group；##P＜0.01，compared with corresponding concentration of ERG group.

2.2 麦角甾醇与吉非替尼联合用药对人肺癌A549，PC-9细胞核形态的影响

Fig.3 Effect of ERG combined with GEF on A549 and PC-9 cells on nuclear morphology by Hoechst 33258 staining.Cells were treated with ERG and GEF according to groups for 48 h.Arrows show the changes of nuclear morphology.

Hoechst 33258染色结果（图3）显示，正常对照组的A549和PC-9细胞发出均匀的蓝色荧光，细胞核形态呈圆形或椭圆形，大小均一，无明显形态学改变；ERG组与GEF组细胞出现核分叶与核碎裂凋亡样特征；两药联用组细胞核具有明显的核形态变化，核分叶与核碎裂，凋亡样小体，细胞核大小不一等凋亡样特征（图中箭头指向处）。

2.3 麦角甾醇与吉非替尼联用对细胞凋亡和细胞周期的影响

2.3.1 麦角甾醇与吉非替尼联用对细胞凋亡的影响

Fig.4 Effect of ERG combined with GEF on A549 cell apoptosis by flow cytometry.A549 cell were treated with ERG 10，20 and 40 μmol·L-1，GEF 10，20 and 40 μmol·L-1，and ERG+GEF（10+10），（20+20），（40+40）μmol·L-1respectively for 48 h.B was A549 cell apoptotic rate in A.±s，n=3，＊＊P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with corresponding concentration of ERG group；△△P＜0.01，compared with corresponding concentration of GEF group.

A549细胞凋亡的流式结果见图4。与对照组相比，ERG 20，40 μmol·L-1及GEF各浓度的凋亡率升高（P＜0.01）。与相应浓度GEF，ERG单药组相比，ERG+GEF联用（10+10）μmol·L-1和（40+40）μmol·L-1组细胞凋亡率升高（P＜0.01）。

PC-9细胞凋亡的流式结果（图5）显示。与对照组相比，ERG各浓度组及GEF各浓度组的凋亡率显著升高（P＜0.01）。与GEF 5，10 μmol·L-1和ERG 40，80 μmol·L-1单药组相比，ERG+GEF（40+5）μmol·L-1和（80+10）μmol·L-1组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。

2.3.2 麦角甾醇与吉非替尼联用对细胞周期的影响

A549细胞周期的流式结果见图6。与对照组G0/G1期细胞比例（56.65±0.13）%相比，ERG 20 μmol·L-1组（58.97±0.94）%及GEF 20 μmol·L-1（72.60±0.81）%单药组G0/G1期细胞比例均升高（P＜0.05，P＜0.01），表明对A549细胞产生了明显的G0/G1期阻滞。与对照组G2/M期比例（29.63±2.15）%相比，ERG 20 μmol·L-1组（32.05±2.27）%细胞比例显著升高（P＜0.01），表明ERG对A549细胞产生明显的G2/M阻滞。与ERG组相比，两药联用组G0/G1期细胞比例显著升高（P＜0.01），G2/M期细胞比例无差异，S期细胞比例显著降低（P＜0.05），与GEF组相比，两药联用组G0/G1期细胞比例显著降低（P＜0.01），G2/M期细胞比例显著升高（P＜0.01），S期细胞比例显著升高（P＜0.05）。表明两药联用改变了A549细胞G0/G1，G2/M，S期的细胞比例，分别为（65.16±1.55）%，（8.74±0.92）%，（26.10±1.11）%。

PC-9细胞周期的流式结果（图7）显示，与对照组S期（19.13±1.20）%及G2/M期（9.64±1.25）%细胞比例相比，ERG 40 μmol·L-1组 S 期（26.93±2.02）%及 G2/M期比例为（13.58±1.80）%细胞比例均显著升高（P＜0.01），说明ERG对PC-9细胞周期产生明显的S期及G2/M期阻滞。而GEF 5 μmol·L-1组 G0/G1期细胞比例（78.35±1.58）%比对照组（71.23±0.44）%显著升高（P＜0.01），说明 GEF 5 μmol·L-1可阻滞细胞于 G0/G1期。与 GEF 组相比，两药联用时，PC-9细胞G0/G1期细胞比例（78.91±1.86）%，S期细胞比例为（13.18±3.16）%，G2/M期细胞比例（8.74±0.92）%无差异。表明两药联用未使PC-9细胞周期发生改变。

Fig.5 Effect of ERG combined with GEF on PC-9 cell apoptosis by flow cytometry.PC-9 cell were treated with ERG 20，40 and 80 μmol·L-1，GEF 2.5，5 and 10 μmol·L-1and ERG+GEF（20+2.5），（40+5），（80+10）μmol·L-1respectively for 48 h.B was PC-9 cell apoptotic rate in A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with corresponding concentration of ERG group；△△P＜0.01，compared with corresponding concentration of GEF group.

Fig.6 Effect of ERG combined with GEF on A549 cell cycle by flow cytometry.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the control group.##P＜0.01，compared with ERG group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with GEF group.

Fig.7 Effect of ERG combined with GEF on PC-9 cell cycle distribution by flow cytometry.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.4 麦角甾醇与吉非替尼联用对Akt，p-Akt，EGFR和p-EGFR蛋白表达的影响

Western印迹结果（图8）显示，在A549细胞中，与对照组相比，GEF 20 μmol·L-1组的p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白表达水平降低（P＜0.01，P＜0.05）；ERG 20 μmol·L-1组的p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白表达水平无明显变化；与GEF单药相比，两药联用组（20+20 μmol·L-1）的p-EGFR/EGFR蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。表明ERG和GEF联用能更好抑制EGFR相关信号通路相关蛋白的表达。

Fig.8 Effect of ERG combined with GEF on protein expression of p-Akt/Akt and p-EGFR/EGFR in A549 and PC-9 cells by Western blotting.See Fig.6 and 7 for the cell treatment.A2-D2 were semi-quantitative results of A1-D1，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with ERG group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with GEF group.

在PC-9细胞中，与对照组相比，GEF 5 μmol·L-1组的p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白表达水平均降低（P＜0.01），ERG 40 μmol·L-1组的p-Akt/Akt与p-EGFR/EGFR蛋白表达水平无显著差异；与GEF 5 μmol·L-1单药组相比，两药联用后 p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白表达显著下调（P＜0.05，P＜0.01）。表明ERG和GEF联用能更好抑制EGFR和Akt信号通路相关蛋白的表达。

3 讨论

本研究结果表明，对于GEF耐药细胞A549细胞，在GEF 5～160 μmol·L-1和ERG 5～160 μmol·L-1均能抑制A549细胞的生长，且呈浓度依赖性，在一定浓度下具有协同作用。对于GEF敏感细胞PC-9细胞，在 GEF 0.625～20 μmol·L-1和 ERG 5～160 μmol·L-1均能抑制PC-9细胞的生长，且呈浓度依赖性，在一定浓度下具有协同作用。Hoechst 33258染色结果显示，两药联用细胞凋亡样特征明显。采用流式细胞仪检测发现，ERG与GEF联用的凋亡率明显高于ERG和GEF单用。且随着药物浓度的增加，细胞凋亡率呈现增加的趋势，有个别组由于两药联用组凋亡率标准差较大，未呈现显著差异。在考察细胞周期时发现，对于A549细胞，两药联用改变了G0/G1，G2/M和S期细胞比例，主要将细胞阻滞在G0/G1期。对于PC-9细胞，两药联用未改变G0/G1，G2/M和S期细胞比例。表明在不同肺癌细胞系，ERG与GEF联用抑制肺癌细胞凋亡的机制不同。在A549细胞中，ERG和GEF联用能更好抑制EGFR相关信号通路的表达。在PC-9细胞中，ERG和GEF联用能更好抑制EGFR，Akt相关信号通路的表达。

本研究的目的旨在探讨ERG与GEF联用能否针对敏感细胞株达到增效、增敏的效果，能否增加耐药细胞株的敏感性，将药物联合使用，如何能够发挥更大的抗肺肿瘤作用，从而为解决临床GEF耐药性提供思路。在针对其他课题的联合用药试验中[11]，出于增效减毒的目的，将ERG浓度固定，增加化疗药的浓度进行细胞增殖抑制试验，结果表明ERG与其他化疗药联用，起到了增效减毒的作用。在进行本实验时，考虑到是否可以采用药物联用的方式，达到最大的抗肺癌疗效。因此，同时增加ERG与GEF的浓度来进行细胞增殖抑制试验。而联合治疗可通过调节不同的信号转导途径来改善治疗效果。同时，与单药治疗相比，这种策略可以减少药物的不良反应，增加细胞对药物的敏感性[14-15]。结果显示，ERG，GEF组以及两药联用组对A549、PC-9细胞的增殖均有一定的抑制作用，且呈现一定的浓度与时间依赖效应。在这一部分实验中，A549细胞中ERG 10 μmol·L-1与GEF 10 μmol·L-1联用，协同作用优于ERG 20 μmol·L-1+GEF 20 μmol·L-1。根据MTT实验结果，后续实验采用了ERG 10 μmol·L-1+GEF 10 μmol·L-1进行，但凋亡实验结果不尽人意。MTT实验主要针对细胞抑制，凋亡实验主要考察细胞的凋亡，实验目的不同。出于该考虑，后续进行了 ERG 10 μmol·L-1+GEF 10 μmol·L-1和 ERG 20 μmol·L-1+GEF 20 μmol·L-12种浓度预实验，在凋亡染色试验和Western印迹实验中，均发现ERG 20 μmol·L-1+GEF 20 μmol·L-1（浓度相对高），实验结果有显著性差异，因此最终选择该浓度进行后续实验。

采用流式细胞仪检测细胞凋亡时发现，ERG和GEF联用在PC-9细胞上的凋亡率要远远高于A549细胞中，可能是因为GEF对PC-9细胞敏感，对A549细胞不敏感，ERG导致细胞死亡的主要途径可能不是通过凋亡途径发生的，而是通过自噬等其他途径发生的。细胞周期实验中，ERG组相对于对照组，能引起S期细胞比例极显著增加，ERG+GEF组能导致2种细胞的G0/G1期阻滞抑制其增殖，从而抑制肿瘤进一步的发展恶化。

EGFR家族成员在肺癌的发展过程起重要的作用，其在40%～80%的非小细胞肺癌中过度表达，与肿瘤的生长、增殖、运动、黏附、侵袭、凋亡和转移等密切相关。EGFR是HER/ErbB家族中的一个跨膜蛋白，与胞外因子结合后能通过一系列的下游信号通 路 ，如 Ras/Raf/MAPK[16]，PI3K/Akt[17]和 Jak/STAT3[18]等，影响下游蛋白c-Fos，c-Jun，Bad，胱天蛋白酶9和叉头转录因子等，从而达到促进细胞分裂、增加细胞增殖、转化、转移的作用。GEF的作用机制就是与ATP竞争EGFR上的结合位点，从而达到抑制磷酸化、阻断信号通路的效果[19]。因此，在Western印迹实验中，选择了EGFR及下游相关信号通路Akt的表达。结果ERG+GEF组的p-Akt/Akt水平和p-EGFR/EGFR水平均极显著降低，表明两药联用能在一定程度上抑制EGFR信号通路的表达。而PI3K/Akt/mTOR信号通路是EGFR信号通路的下游信号通路，因此推测是否两药联用能在一定程度上抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的表达，从而使肿瘤细胞产生凋亡。

本研究的不足之处在于ERG与GEF联用，对GEF敏感的PC-9细胞能够起到增效、增敏作用，对GEF耐药的A549细胞能增加其一定的敏感性，但对于机制研究只进行了初步探讨。近年来许多研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路在肿瘤细胞中发挥重要的作用。因此，有关ERG与GEF联用抗肿瘤更全面的分子机制有待进一步研究。