匹诺塞林对高血糖诱导的大鼠卒中后出血转化的作用

孔令雷，陈燕霞，，刘楠楠，3，马国栋，杨海光，石瑞丽，杜冠华

（1.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京100050；2.包头医学院生理学教研室，内蒙古 包头 014060；3.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006）

卒中作为一种严重威胁人类健康的疾病，目前仍缺乏有效的治疗药物。组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，t-PA）是目前唯一被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于卒中治疗的溶栓药，有效治疗时间窗为3～4.5 h。临床研究表明，t-PA可使出血转化（hemorrhagic transformation，HT）的发生率增加10倍，死亡率达到60%，只有约3.4%～5.2%卒中患者可接受t-PA治疗[1]。HT是急性脑梗死后发生的脑内出血，是卒中的常见严重并发症，导致死亡率和致残率增加。缺血性卒中HT的发生率高达48%，主要发生于初次卒中后2～3 d[2]，是影响患者死亡和预后的重要原因。HT的发生既是卒中病理发展的结果，也与溶栓药物的使用和机体状态有关[3]。临床对于HT的治疗主要是手术干预，但效果较差。因此，寻找预防和治疗HT的药物对于卒中的治疗和预后具有重要意义。

高血糖是卒中后不良预后的预测因子，在HT的发生中发挥重要作用[4]。在卒中患者中，约有40%患者存在糖尿病和高血糖，因而导致死亡率较高，预后较差。临床研究表明，高血糖是t-PA溶栓治疗后HT发生的强预测因子[5]。动物实验研究也发现，高血糖大鼠经过大脑中动脉堵塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）手术后出血发生率达到100%[6]。高血糖引起HT的机制主要与酸中毒有关[7]。此外，高血糖还可诱导基质金属蛋白酶、活性氧和促炎细胞因子的产生，进而导致血管损伤并引起出血[8]。

匹诺塞林（pinocembrin）是从蜂胶中提取、通过高通量筛选技术获得的一种具有抗脑缺血作用的天然黄酮类化合物，是抗脑缺血Ⅰ类新药，目前正在进行Ⅱ期临床研究。非临床研究表明，该药在多种脑缺血动物模型中均具有抗脑缺血作用，可减小脑梗死体积，减轻脑水肿和神经功能损伤，改善学习记忆能力等，有效治疗时间窗≥6 h[9]。其具有扩张血管、抑制炎症反应、保护线粒体功能、抑制细胞凋亡和自噬等多方面的作用[10-13]，提示该药可能通过多个靶点和通路发挥作用。本研究集体前期通过t-PA溶栓诱导的大鼠HT模型研究发现，匹诺塞林能减少大鼠脑梗体积，改善神经功能，抑制t-PA诱导的HT的发生和发展[14]。为进一步明确该药对HT的治疗作用，本研究制备急性高血糖诱导的大鼠HT模型，观察其抗HT的作用，以期为扩大匹诺塞林的临床适应证提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

SD（Sprague Dawley）大鼠，SPF级，雄性，体质量220～240 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0006，饲养于中国医学科学院药物研究所动物房，明暗交替（12/12 h），环境温度22～24℃，相对湿度为40%～60%，自由进食进水。动物实验遵循北京协和医学院动物伦理委员会规定。

注射用匹诺塞林（10 mg，批号：20061101）由中国医学科学院药物研究所提供；伊文斯蓝（EB）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）和三氯乙酸购于美国Sigma公司；血红蛋白检测试剂盒购于美国博世生物技术有限公司；线栓购于河北天浓生物科技有限公司；实验用水均为双蒸水。

血糖仪和血糖试纸（罗氏公司）；ALC-HTP动物恒温系统（上海奥尔科特生物科技有限公司）；WZS-50F6双道微量注射泵（浙江史密斯医学仪器有限公司）；TX223L电子天平（日本岛津公司）；BT100-2J LongerPump（保定兰格恒流泵有限公司）；连续光谱酶标测试仪（Molecular公司）；DHX-9243B电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）。

1.2 大鼠MCAO模型制备

10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，之后将其仰卧位固定在放有保温垫的鼠板上。用乙醇棉球擦拭颈部皮肤，颈前正中剪开皮肤约1.5 cm，钝性分离皮下肌肉和薄膜等，分离颈总、颈内和颈外动脉。分别在颈总、颈外和颈内动脉埋线，将颈外系死，颈总和颈内动脉夹闭，颈外动脉剪一小口，插入特制尼龙线，松开颈总和颈内动脉，将栓线插入18 mm阻塞到大脑中动脉，90 min后拔栓进行再灌，之后缝合皮肤，放于笼中饲养。

1.3 实验分组

大鼠随机分为4组：假手术组、MCAO模型组、高糖+MCAO模型组、高糖+匹诺塞林+MCAO组，每组21只。假手术组只分离颈动脉，不插入线栓；MCAO模型组进行MCAO手术，但不注射葡萄糖；高糖+MCAO模型组在MCAO手术前30 min腹腔注射50%葡萄糖；高糖+匹诺塞林+MCAO组在高糖模型再灌前5 min尾静脉注射匹诺塞林。参考在脑缺血模型和t-PA诱导的HT模型中匹诺塞林量效关系的研究结果，匹诺塞林10 mg·kg-1作用最显著，因此本研究选择该剂量进行研究[14]。

1.4 血糖仪测定血糖

分别于大鼠注射葡萄糖前、后30 min及MCAO术后1，2和3 h，尾静脉取血至血糖试纸，用血糖仪测定血糖。

1.5 行为学评分

MCAO术后24 h，采用改良的大鼠神经功能缺损评分法（modified Neurological Severity Scores，mNSS）评分，观察大鼠的运动、感觉和反射功能。运动功能包括提尾实验、地板实验和平衡木实验。提尾实验评分：前肢屈曲（1分），后肢屈曲（1分），30 s内头上仰（1分）；地板实验评分：不能走直线（1分），偏瘫（1分），旋转（1分）；平衡木实验评分：紧抓平衡木边缘（1分），紧抓平衡木但一肢体从平衡木垂落（2分），紧抓平衡木但二肢体从平衡木上垂落或在平衡木上旋转（＞60 s）（3分），试图在平衡木上保持平衡但跌落（＞40 s）（4分），试图在平衡木上保持平衡但跌落（＞20 s）（5分），直接跌落、未尝试在平衡木上平衡（＜20 s）（6分）。感触觉实验评分：视觉和触觉放置（1分），本体觉放置（1分）；反射功能测试评分：耳廓反射（1分），角膜反射（1分）。

1.6 脑梗死体积测定

行为学评分完毕后，使用10%水合氯醛麻醉，从心尖处注入生理盐水灌流取脑。将大脑冠状切成6片，置6孔板中，避光加1%TTC，37℃恒温染色20 min，4%多聚甲醛固后拍照，用Image J计算每个脑切片的梗死面积，并计算脑梗死体积。脑梗死体积（%）=〔梗死体积-（梗死侧大脑体积-对侧大脑体积）〕/对侧大脑体积×100%。

1.7 脑组织血红蛋白含量检测

另取一批大鼠，每组6只，MCAO术后24 h，同样灌流取脑，冠状切片、拍照观察出血情况，将两侧脑组织分别称重并记录后，置匀浆器中。参考试剂盒说明书操作，以1∶1体积比加0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液匀浆，4℃，12 000×g离心30 min，吸取上清液50 μL于96孔板中，加反应试剂200 μL后室温放置15 min后，在400 nm处测A400nm值，按试剂盒说明书计算获得血红蛋白含量。

1.8 HE染色观察脑组织的病理变化

每组取3只大鼠，MCAO术后24 h，同样灌流取脑，4%多聚甲醛灌流固定后，取全脑，置4%多聚甲醛中，石蜡包埋、切片，进行HE染色，观察脑组织的病理变化。

1.9 脑组织EB含量测定

另取一批大鼠，每组6只，MCAO术后24 h，尾静脉注射4%EB，2 h后，同样灌流取脑，冠状切片、拍照观察EB渗漏情况。将两侧脑组织分别称重并记录后，置匀浆器中，以1∶3体积比加50%三氯乙酸匀浆，4℃，12 000×g离心5 min后，吸取上清液100 μL于96孔板中，在620 nm处测A620nm值。标准曲线通过在正常大鼠脑组织匀浆中加不同浓度EB制备。

1.10 出血发生率和死亡率的统计

全部实验结束后，统计造模成功的大鼠数量，造模成功后死亡的大鼠数量，通过脑切片观察出血情况并统计发生出血的大鼠数量。出血发生率（%）=发生出血的大鼠数量/造模成功的大鼠数量×100%；死亡率（%）=造模成功后死亡的大鼠数量/造模成功的大鼠数量×100%。

1.11 统计学分析

实验结果数据以±s表示，采用GraphPad Prism软件单因素方差分析（one-way ANOVA）及组间t检验分析各组数据。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 匹诺塞林对急性高血糖MCAO模型大鼠血糖水平的影响

为保证高血糖模型的成功，首先检测了不同时间点血糖值的变化（图1）。与假手术组相比，MCAO模型组各时间点血糖水平均无明显变化；高糖+MCAO模型组大鼠腹腔注射葡萄糖30 min后，血糖由注射前的4.0升高至20.9 mmol·L-1，随后随时间延长逐渐下降；注射后各时间点均显著高于MCAO模型组（P＜0.01），表明急性高血糖MCAO模型制备成功。高糖+匹诺塞林+MCAO组血糖与高糖+MCAO模型组比较无明显变化，表明匹诺塞林对急性高血糖MCAO模型大鼠血糖水平无明显作用。

Fig.1 Effect of pinocembrin（Pino）on blood glucose at different time points in acute hyperglycemic（HG）middle cerebral artery occlusion（MCAO）model rats.Rats were randomly divided into sham group，MCAO group，HG+MCAO group and HG+Pino+MCAO group.The rats in HG+MCAO group received an intraperitoneal injection of 50%glucose（6 mL·kg-1）.Pino（10 mg·kg-1）was administrated 5 min before reperfusion.Before injection of glucose，30 min after injection and 1，2 and 3 h after MCAO，blood was collected from the tail vein and blood glucose was measured with blood glucose meter.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MCAO group.

2.2 匹诺塞林对急性高血糖MCAO模型大鼠神经功能的影响

术后24 h采用mNSS评分法观察匹诺塞林对模型大鼠神经功能的作用（图2）。假手术组大鼠无神经功能损伤；MCAO模型组行为学评分为9.4±1.5，明显高于假手术组（P＜0.01）；高糖+MCAO模型组的行为学评分为10.0±0.6，与MCAO模型组比较无明显变化，表明高血糖并未加重神经功能损伤；高糖+匹诺塞林+MCAO组大鼠行为学评分降至7.4±1.1，与高糖+MCAO模型组比较明显降低（P＜0.01），表明匹诺塞林具有改善急性高血糖MCAO模型大鼠神经功能的作用。

Fig.2 Effect of pino on neurological function in acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.mNSS：modified Neurological Severity Scores.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with HG+MCAO group.

2.3 匹诺塞林对急性高血糖MCAO模型大鼠脑梗死体积的影响

假手术组大鼠无脑梗变化；缺血1.5 h后，MCAO模型组大鼠脑组织出现明显脑梗，脑梗体积为（23.3±11.3）%（P＜0.01）；高糖+MCAO模型组大鼠脑梗体积与MCAO模型组相比进一步增加（P＜0.05），达到（36.9±8.2）%；高糖+匹诺塞林+MCAO组大鼠脑梗体积降至（26.9±5.8）%，与高糖+MCAO模型组比明显降低（P＜0.05）（图3A和3B）。

Fig.3 Effect of pino on infarct volume in acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：representative TTC stained images；B：bar graph of infarct volume.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，compared with MCAO group；ΔP＜0.05，compared with HG+MCAO group.

2.4 匹诺塞林对急性高血糖MCAO模型大鼠脑组织中血红蛋白含量的影响

假手术组大鼠无脑出血；缺血1.5 h后MCAO模型组大鼠有轻微脑出血，与假手术组相比无明显变化；与MCAO模型组相比，高糖+MCAO模型组大鼠脑组织内血红蛋白含量明显升高（P＜0.01）；高糖+匹诺塞林+MCAO模型组大鼠脑出血与高糖+MCAO模型组相比明显减轻（P＜0.01）（图4A和图4B）。HE染色结果（图4C）也表明，MCAO模型组出血轻微，高糖+MCAO模型组出血严重，高糖+匹诺塞林+MCAO模型组较高糖+MCAO模型组出血减轻。以上结果均提示，匹诺塞林具有抑制高血糖诱导出血发生的作用。

Fig.4 Effect of pino on hemorrhagic transformation（HT）in acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：representative images of HT；B：bar graph of hemoglobin；C：representative images of HE staining.The arrows represent bleeding.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with MCAO group；ΔΔP＜0.01，compared with HG+MCAO group.

2.5 匹诺塞林对急性高血糖MCAO模型大鼠脑组织中EB含量的影响

缺血1.5 h后，MCAO模型组大鼠脑组织中EB含量与假手术组比无显著性差异；高糖+MCAO模型组大鼠脑组织中EB含量与MCAO模型组相比显著增加（P＜0.05），高糖+匹诺塞林+MCAO模型组与高糖+MCAO模型组相比显著降低（P＜0.05），表明匹诺塞林能保护血脑屏障（blood brain barrier，BBB）（图5A和5B）。

Fig.5 Effect of pino on Evans blue（EB）leakage in acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：representative images of EB；B：bar graph of EB.x ± s，n=6.＊P＜0.05，compared with MCAO group，#P＜0.05，compared with HG+MCAO group.

2.6 匹诺塞林对急性高血糖MCAO模型大鼠出血发生率和死亡率的影响

全部实验结束后统计大鼠出血发生率和死亡率。从出血发生率来看，MCAO模型组出血发生率为18.2%，高糖+MCAO模型组出血发生率高达95.4%，高糖+匹诺塞林+MCAO模型组出血发生率降至59.1%（图6A）。大鼠死亡率的统计结果表明，MCAO模型组大鼠死亡率为16.7%，高糖+MCAO模型组的死亡率升至57.3%，高糖+匹诺塞林+MCAO模型组的死亡率可降至18.9%（图6B）。以上结果表明，匹诺塞林不仅降低出血发生率，还可以降低大鼠死亡率。

Fig.6 Effect of pino on hemorrhagic transformation（HT）rate（A）and mortality rate（B）of acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.

3 讨论

在影响卒中的各种风险因素中，卒中发作后24 h内高于7 mmol·L-1的血糖水平与脑损伤的恶化和死亡率的增加相关[15]。高血糖症可由糖尿病引起，也可来自食物摄入、葡萄糖输注、生理应激或皮质类固醇的使用。糖尿病患者的卒中风险明显增加，比一般人群高4～12倍。此外，由于全身应激反应和糖皮质激素水平升高，20%～50%卒中患者会出现高血糖[16]。上述研究说明，高血糖是通过升高葡萄糖而非糖尿病并发症加重卒中损伤。已有研究表明，高血糖是卒中的独立危险因素[17]，同时血清葡萄糖和糖尿病也是t-PA溶栓后HT的预测因子。

目前用于HT研究的动物模型主要有急性高血糖MCAO模型、糖尿病MCAO模型和t-PA溶栓诱导的HT模型。t-PA诱导的HT模型与t-PA的给药时间密切相关，随给药时间的延长HT的发生风险增加，但无法达到100%的成模率，且t-PA成本较高。糖尿病MCAO模型需先建立糖尿病模型，再进行MCAO手术，费时费力。急性高血糖MCAO模型通过术前30 min腹腔注射50%葡萄糖即可成功建立HT模型，且成模率接近100%，简单易行，适用于HT治疗药物的评价。本研究采用急性高血糖诱导的HT模型，HT发生率为95.4%，表明模型建立成功，可用于药物的评价。在此基础上，观察了匹诺塞林对HT的作用，发现其能降低脑梗体积和出血。从HT的发生率、严重程度和大鼠生存率来看，匹诺塞林作用显著。该药使HT发生率从95.4%降至59.1%，生存率从42.7%提高到81.1%，且显著降低出血的严重程度。上述结果表明，匹诺塞林对高血糖诱导的HT具有显著的保护作用。

HT的发生机制与BBB的破坏相关[18]。高血糖可增加活性氧并引发其依赖性信号转导。高血糖通过诱导酸中毒，增加神经元和胶质细胞的损伤[15，19]。此外高血糖还可促进炎症反应的激活[20]。这些因素的共同作用导致了BBB的破坏和神经细胞的死亡，促进HT的发生。通过检测脑组织中EB含量证实高血糖可加重BBB损伤，导致EB渗漏进一步增加，而匹诺塞林显著降低EB含量，提示其对BBB具有保护作用，进而抑制HT的发生。此外，在本研究中通过检测血糖水平发现，匹诺塞林对于注射葡萄糖引起的高血糖水平并无降低作用，表明其并不是通过调节血糖发挥抗HT作用，可能存在其他作用途径。前期研究发现，匹诺塞林具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用，可以通过多靶点多途径保护神经血管单元[11]。因此推测，匹诺塞林对于高血糖引起的HT的治疗作用也是通过多靶点实现的，其具体作用机制尚需进一步研究。

综上所述，匹诺塞林可减轻高血糖诱导的HT，降低出血的发生率和死亡率，可能是一种具有潜力的抗HT药物。本研究为扩大匹诺塞林的临床适应证提供了实验依据。