丙酮-冰醋酸在线衍生化-顶空气相色谱法测定氯唑沙宗中水合肼含量

张广仁，王南南，彭纪铭，刘发贵，刘思光，李铁建，张贵民

（鲁南制药集团股份有限公司国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 276000）

氯唑沙宗为中枢性肌肉松驰药，作用于脊髓内神经肌腱反射多突触通道而产生肌肉松弛，临床用于治疗各种急、慢性肌肉酸痛、慢性筋膜炎及由中枢神经病变引起的肌肉痉挛等症[1]。氯唑沙宗生产工艺中可能存在水合肼杂质，影响产品质量[2-9]。本文用丙酮作为衍生化试剂，采用顶空瓶为衍生器，采用恒温孵化的方式对药物中残留肼进行衍生化，分析了氯唑沙宗中水合肼的残留量[10]。本法样品前处理过程简单、省时，方法灵敏度高、选择性好，可用于氯唑沙宗质量控制。

1 仪器与试剂

Agilent 7890B型气相色谱仪（美国安捷伦公司），配有分流-不分流进样口和通用型FID检测器；Agilent 7697A顶空进样器（美国安捷伦公司）；氯唑沙宗原料药（山东新时代药业）；水合肼对照品（分析纯，阿拉丁）；丙酮（色谱纯，美国赛默飞世尔公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

进样口温度为200 ℃；分流比1:1；检测器温度为300 ℃；载气为氮气；流速为6 ml/min；DBWAX色谱柱（30 m×0.53 mm，0.5 µm），起始柱温45 ℃，维持1 min，以20 ℃/min的速率升温至230 ℃，维持2 min；顶空瓶孵化温度80 ℃，孵化时间30 min。

2.2 溶液制备

2.2.1 稀释液 精密量取冰醋酸1 ml，置1000 ml量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀，作为冰醋酸-丙酮溶液；量取冰醋酸-丙酮溶液100 ml，置1000 ml量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取氯唑沙宗原料药约2 g，精密称定，置10ml量瓶中，加入稀释液溶解并定容至刻度，作为供试品溶液。

2.2.3 对照品溶液 取水合肼约0.1 g，精密称定，置10 ml量瓶中，加入稀释液溶解并定容至刻度，作为对照品储备液。精密量取储备液0.05 ml，置50 ml量瓶中，定容至刻度，作为对照品溶液。

2.2.4 加标供试品溶液 取氯唑沙宗原料药约2 g，置10 ml量瓶中，加入对照品溶液溶解并定容至刻度，作为加标供试品溶液。

2.3 衍生条件

准确称取一定量的样品，置顶空瓶中，加入适量稀释液，密封，80 ℃下孵化30 min，即可衍生完全[7]。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 分别精密量取空白溶剂、对照品溶液、加标供试品溶液各2 ml，顶空进样，记录色谱图（见图1）。由图1可见，空白溶剂对水合肼的检出无干扰。

图1 氯唑沙宗GC图谱

2.4.2 线性与范围 取对照品储备液，分别逐级稀释成系列不同浓度的对照品溶液，分别精密量取上述对照品溶液各2 ml，顶空进样，记录色谱图。以对照品浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，回归方程为Y=0.132X+0.0135，r=0.9994，表明水合肼在0.507～20.294 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.4.3 溶液稳定性 室温条件下，分别于0，2，4，6，8，10 h，精密量取对照品溶液和加标供试品溶液各2 ml，顶空进样，记录色谱图。结果表明：对照品溶液于室温放置10 h，峰面积RSD为8.0 %；加标供试品溶液于室温放置10 h，峰面积RSD为4.4 %，表明对照品溶液及测试溶液于室温放置10 h内稳定。

2.4.4 定量限和检出限 精密量取2.2.3项下对照品溶液1 ml，置20 ml量瓶中，加稀释液溶解至刻度。进一步稀释至不同浓度，顶空进样，记录色谱图。水合肼的检出限（S/N=3:1）为0.169 µg/ml，定量限（S/N=10:1）为0.507 µg/ml。

2.4.5 加样回收试验 分别精密称取氯唑沙宗原料药9份，每份约2 g，分别置入10 ml量瓶中，其中3份加8.125 μg/ml的对照品溶液溶解并稀释至刻度，作为80 %测试溶液；3份加10.157 μg/ml的对照品溶液溶解并稀释至刻度，作为100 %测试溶液；3份加12.188 μg/ml的对照品溶液溶解并稀释至刻度，作为120 %测试溶液，用9份测试溶液的测定结果计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.4.6 重复性和中间精密度 按2.2.4项下方法制备6份同一浓度的加标供试品溶液，1 d内重复进样6次，计算重复性，其含量RSD值为3.6 %；按2.2.4项下方法制备6份同一浓度的加标供试品溶液，不同分析人员在不同日期、不同仪器上考察中间精密度，其含量RSD值为3.1 %。

2.4.7 耐用性 分别考察了顶空进样器平衡时间、顶空进样器平衡温度、进样口温度、色谱柱流速在一定范围内变化时对色谱分离的影响。顶空进样器平衡时间变化±5 min，顶空进样器平衡温度变化±5 ℃，进样口温度变化±5 ℃，色谱柱流速变化±0.1 ml/min，水合肼检出量的RSD为5.1 %，符合验证要求。

2.5 样品检测

取3批氯唑沙宗，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，顶空进样。结果3批样品均未检出水合肼残留。

3 讨论

3.1 样品衍生条件选择

本文选用丙酮为衍生化试剂，以冰乙酸为催化剂，以衍生物含量为指标，采用单因素试验分别考察反应温度和反应时间对反应程度的影响。研究发现，当反应温度为80 ℃，反应时间为30 min时，衍生反应完全。

3.2 色谱条件的选择

本文对比了热导检测器和氢火焰离子化检测器对水合肼的响应差异，发现氢火焰离子化检测器灵敏度可满足分析要求。同时比较了非极性色谱柱（DB-1）、弱极性色谱柱（TG-624）、强极性色谱柱（DB-WAX）对水合肼衍生物的选择性，发现DB-WAX色谱柱可使水合肼衍生物峰形对称。

水合肼是强碱性化合物，存在极性大，毒性强，限度低，检出难度高的问题[11-14]。通过对水合肼衍生化，可增加水合肼在氢火焰离子化检测器上的灵敏度，同时衍生条件简单，无需转移即可进样分析，提高效率。