玻璃酸二甲基硅烷醇复合物对鼻黏膜上皮细胞的作用研究

刘 霞，张小刚，郭新艳，陈建英, ，刘 飞，凌沛学,

（1. 山东省药学科学院 博士后科研工作站 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室，山东 济南 250101；2. 山东福瑞达医药集团有限公司 山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东 济南 250101 ）

近年，日益严重的空气污染已成为我国大部分地区面临的严重环境问题。研究发现空气污染物中主要含二氧化硫、氮氧化物、烟碱和强致癌性的苯并芘、亚硝胺等有害成分[1]。流行病学研究表明空气污染可诱发鼻腔炎性疾病，空气污染严重的地区人群中流鼻涕、鼻子痒干、鼻塞、流鼻血、打喷嚏等症状发生率均高于空气质量良好的地区[2-3]。鼻腔黏膜上皮细胞作为鼻腔直接与空气接触的第一道天然防线，具有活跃的分泌功能，在外界理化因素的刺激下，释放细胞因子作用于其他细胞，在鼻腔、鼻窦的慢性炎症、损伤修复及重塑过程中发挥重要作用。空气污染物易使呼吸间鼻腔黏膜产生不适，适时对鼻腔进行清洗，能在滋润鼻腔黏膜的同时，起到抗菌作用。

玻璃酸（hyalouronic acid，HA）又名透明质酸，是由D-葡糖醛酸（GlcA）和N-乙酰氨基葡糖（GlcNAc）双糖单位通过交替的β-1, 3和β-1, 4糖苷键连接而成的线性高分子酸性黏多糖。HA是构成皮肤细胞外基质的主要成分之一，具有良好的吸湿性，能携带自身500倍以上的水分，是目前公认的最佳天然保湿因子，广泛应用于眼科、骨科、保健品、化妆品等领域[4]。玻璃酸二甲基硅烷醇复合物（dimethyl silanol hyaluronate，DSHA）是HA的二甲基硅烷醇衍生物，研究表明DSHA无皮肤刺激性，无细胞毒性，与HA相比，保湿性更佳，研究发现DSHA还具有促进皮肤角质细胞增殖的作用[5]。目前市售鼻腔护理产品多以高渗或等渗盐水和海水为主要成分，主要作用是对鼻腔的清洗。然而，日常使用盐水或海水对鼻腔进行清洗后，大部分鼻腔黏膜正常分泌的黏液被冲洗液带走，空气中的有害颗粒、雾霾成分和有害气体直接接触鼻腔黏膜表面，刺激黏膜引起鼻腔干痒症状，症状的解除依赖于新的黏液分泌。前期我们在研究中发现 DSHA具有高效保湿、润滑和减少黏湿感的优点，与黏膜组织有较好的亲和性，用于鼻腔冲洗液可在黏膜和纤毛表面形成较薄的液层，起到隔离和润湿功能，可有效减轻盐水或海水冲洗之后造成的鼻腔干痒症状。但含DSHA的鼻喷剂的细胞毒性及是否具有抑制空气污染物对鼻黏膜上皮细胞损伤的保护作用，目前尚不清楚。

本研究采用噻唑蓝（MTT）法对DSHA原料药及含DSHA的鼻喷剂在鼻黏膜上皮细胞的细胞毒性进行研究，并以苯并芘（BAP）刺激离体培养的鼻黏膜上皮细胞，模拟雾霾对鼻黏膜的损伤，对DSHA的保护作用进行研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

倒置相差显微镜（Nikon）：酶标仪（Tecan，Infinite M200 PRO）。

1.2 试剂

DSHA药用原料，含DSHA的鼻喷剂，不含DSHA的鼻喷剂对照（山东福瑞达生物工程有限公司）；DMEM/F12培养基（Gibco）；胎牛血清（FBS，Gibco）；青、链霉素（BI）；胰蛋白酶（Gibco）；MTT（Sigma）；二甲基亚砜（DMSO，上海生工）；BAP（Sigma）；肿瘤坏死因子α（TNF-α），白介素1（IL-1），IL-8检测试剂盒（南京建成）；实验用水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 鼻黏膜上皮细胞的分离

取新西兰大白兔的鼻黏膜，用含双抗（100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）、4 ℃预冷的PBS溶液对组织进行冲洗，将菲薄的黏膜层从黏膜下组织小心地分离下来（略呈黄色的一面是上皮层），黏膜剪碎后加入0.1 % I型胶原酶消化（37 ℃孵育30 min），消化后在上述有黏膜块的酶溶液内直接加入等量的0.25 %胰蛋白酶，轻轻吹打5 min，移除黏膜块，细胞悬液离心（1200 r/min，5 min），弃上清，细胞沉淀中加入适量含10 %FBS的培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶。

2.2 细胞培养

兔鼻黏膜上皮细胞加含10 %胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于25 cm2培养瓶，于5 %CO2、37 ℃培养箱培养。

2.3 MTT法检测DSHA的细胞毒性

取对数生长期的兔鼻黏膜上皮细胞，以1×105个/ml的密度，接种于96孔板，每孔100 µl，置5 %CO2、37 ℃培养箱内培养24 h，弃掉96孔板中培养基，试验组分别加入100 µl供试液。试验组设正常组（加入新鲜培养基）、阴性对照组（加入生理盐水）、盐水鼻腔喷雾剂组（分别含0.001 %，0.002 %，0.003 %，0.004 %，0.005 %DSHA）、黏膜用DSHA原料组（分别含0.002 %，0.004 %，0.008 %，0.01 %，0.02 %，0.03 %，0.04 %，0.05 %DSHA），每组设6个复孔，继续培养24 h。弃去孔内液体，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 µl ，继续培养4 h，吸去培养液，加入100 µl DMSO，摇床上低速振荡10 min。震荡平板，以酶标仪测定各孔490 nm处的OD值，计算细胞相对增殖率。

2.4 DSHA对BAP引起的细胞损伤的保护作用检测

多环芳烃是一类常见的大气中的有毒物质，BAP是多环芳烃中毒性最大的一种强致癌物质，可对人类内脏器官、神经系统造成损害，还会造成DNA的损伤，诱发细胞癌变[6-8]。BAP是最主要的大气污染监测对象之一。本研究以5 µg/ml BAP造模，模拟大气污染对鼻黏膜细胞的损伤。取对数生长期的兔鼻黏膜细胞，以1×105个/ml的密度接种于96孔板，置于37 ℃、CO2培养箱培养，24 h后加药处理各测试组细胞。细胞分组：（1）正常组：每孔加入完全培养液（含10 %FBS）100 µl；（2）对照组：每孔加入含DMSO（最终质量浓度0.2 %）的基础培养液100 µl；（3）BAP组：每孔加入含BAP（最终质量浓度5 µg/ml）的基础培养液100µl；（4）BAP+DSHA组：每孔加入含BAP（最终质量浓度5 µg/ml）和 DSHA（最终质量浓度0.001 %）的基础培养液100 µl。继续培养24 h，利用MTT法检测细胞存活率的变化。

2.5 细胞上清中TNF-α、IL-1、IL-8含量的测定

提取细胞培养上清，4 ℃，12000×g离心15 min，收集上清于冰上预冷的EP管中，分别采用TNF-α、IL-1和IL-8 ELISA检测试剂盒，参照试剂盒说明书，检测各组细胞中TNF-α、IL-1和IL-8含量。

2.6 数据统计分析

所有试验数据来自3次独立的重复实验，实验采用 SPSS13.0统计软件进行数据分析，数据以±s表示，采用单因素方差分析进行多组间差异分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 DSHA对兔鼻黏膜细胞的细胞毒性

细胞毒性结果见表1。由表1可见，DSHA原料在0.002 %～0.05 %的浓度范围内、盐水鼻喷雾剂在0.001 %～0.005 %的浓度范围内，细胞存活率均＞99 %，判定为无细胞毒性。

表1 DSHA对各组细胞存活率的影响

3.2 DSHA抑制BAP引起的鼻黏膜细胞的损伤

结果见图1。由图1可见，与正常组相比，对照组细胞存活率（60.59 %±1.74 %）显著降低（P＜0.01）；与对照组相比，BAP处理组的细胞存活率显著降低至48.18 %±1.63 % （P＜0.01），DSHA可显著逆转这一趋势（P＜0.01），细胞存活率上升至62.14 %±1.87 %。这表明DSHA可显著抑制BAP引起的鼻黏膜细胞存活率的下降。

图1 DSHA对BAP引起的鼻黏膜细胞损伤的保护

3.3 DSHA对鼻黏膜上皮细胞分泌的炎性因子的影响

研究表明，TNF-α、IL-1、IL-8作为促炎细胞因子，可趋化炎症细胞并释放炎性递质，在迟发超敏反应中发挥重要作用[2,9]，在本研究中，我们对上述3个关键细胞因子进行了研究，结果见表2。培养24 h后, 对照组与正常组相比，TNF-α、IL-1、IL-8 3种炎性因子的含量均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；BAP加入后，细胞中上述3种炎症因子的含量均有不同程度的提高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜ 0.01）；DSHA可显著抑制BAP引起的TNF-α、IL-1、IL-8的含量升高（P＜0.05，P＜0.01）。综上所述，含DSHA的鼻喷剂对BAP引起的鼻黏膜细胞存活率的下降有显著抑制作用，且其发挥作用机制与抑制细胞因子TNF-α、IL-1、IL-8的高表达有关。

4 讨论

随着大气污染的日益加重，患有鼻腔疾病的患者不断增多，鼻腔护理相关制剂的开发成为近年研究人员关注的热点。鼻腔疾病除了用药，鼻腔清洗液的使用对于缓解鼻腔不适也多有益处。本研究发现，含DSHA的鼻喷剂及原料药对鼻黏膜上皮细胞无细胞毒性，且可有效抑制BAP引起的鼻黏膜上皮细胞存活率的下降，降低炎性因子TNF-α、IL-1、IL-8的水平。这为DSHA开发为鼻腔护理用品或医疗器械产品提供了理论基础。

表2 细胞上清中TNF-α、IL-1、IL-8水平的变化