原肌球蛋白1与胶质瘤放射敏感性的体外研究

王冉冉，杜华情，杨坤，王臻，赵梦洁，李泰平，钱春发，刘宏毅，肖红

脑胶质瘤是成年人最常见的原发性脑肿瘤之一，占所有发生于大脑和中枢神经系统的恶性肿瘤中的74.6%[1]。虽然脑胶质瘤在所有癌症中所占的比例不到1%[2]，但其死亡率和发病率却很高。胶质瘤患者2年生存率约为15%，中位总生存期为14 ～17个月[3-4]。目前临床治疗胶质瘤的方法主要是手术治疗、化疗和放疗。放射治疗是治疗恶性肿瘤有效的非手术治疗方法之一，大约50%的癌症患者在治疗过程中会接受放射治疗[5]；但由于胶质瘤细胞的放射抵抗性，导致放射治疗效率较低。因此，寻找提高胶质瘤的放射敏感性的可能靶点具有重要临床意义。原肌球蛋白(tropomyosin,TM)是一种由100% α-螺旋纤维蛋白构成的螺旋状二聚体，广泛分布于真核细胞中。在脊椎动物中，TM主要分成两类：含248～291个氨基酸残基的高分量组(high molecular weight，HMW) 和含 245～251个氨基酸残基的低分量组(low molecular weight，LMW)。在哺乳动物中，TM家族含有4种基因，即原肌球蛋白1(tropomyosin-1,TPM1)(α基因)、 TPM2(β基因)、 TPM3(γ基因)、TPM4(δ基因)，可以产生20种以上的同源异构体[6]；影响细胞活力、细胞粘附和细胞外的相互作用，通过细胞增殖、迁移和侵袭参与癌细胞转移[7-8]。TPM1是TM家族中的一员，是多种细胞中的一种与肌动蛋白结合的细胞骨架蛋白。在肌肉细胞中，TPM1通过与肌动蛋白和肌钙蛋白直接作用来调节肌肉的收缩[9]。在非肌肉细胞中，TPM1主要作为肌动蛋白丝来稳定细胞骨架[10]，也作为细胞形态转化抑制剂在非肌肉细胞中发挥作用[11]。在正常细胞中，TPM1在细胞间传导生长刺激信号，维持细胞正常骨架形态，抑制细胞恶性转化[12]。一旦 TPM1缺失或突变，将导致细胞恶性转化。虽有研究报道TPM1在胶质母细胞瘤中的表达有下降趋势，并发挥抑癌基因的功能[13]，但其与放射敏感性的关系仍不清楚。

本研究采用人脑胶质瘤U251细胞株进行体外实验，沉默和过表达TPM1来研究其与胶质瘤U251细胞放射抵抗性之间的关系，进一步探讨其对胶质细胞瘤的影响，为寻找提高胶质瘤放射敏感性的可能靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人神经胶质瘤细胞株U251(南京凯基生物技术公司)，人神经胶质瘤U251放射抵抗细胞株(RR-U251)[14]，DMEM培养基(Gibco)，双抗(Gibco)，RIPA蛋白提取液、兔源性TPM1多克隆抗体，鼠抗β-tubulin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(南京生兴生物有限公司)，BD基质胶(Invitrogen)，LipotamineTM2000(Invitrogen)，全自动酶标仪(Labsystems Multiskan Ascent)，荧光倒置显微镜(Carl Ziess Axiovert)，流式细胞分选仪(BD FACScan)，化学发光成像系统(CLINX BIO-RAD)，流式细胞分析仪(BD Calibur)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人脑胶质瘤U251细胞株用10%胎牛血清和1%双抗配制的DMEM 培养基，在37 ℃、饱和湿度、5% CO2孵箱中培养，每隔24 h更换1次培养液；随后视细胞生长情况及培养液颜色更换培养液。处于对数生长期的细胞可用于传代或相关实验。

1.2.2 建立沉默和过表达TPM1细胞 采用上海吉玛公司合成shRNAs-TPM1和pcDNA3.1-TPM1质粒。用Western blot法检测转染质粒后TPM1蛋白的表达水平。将shRNAs-TPM1(pcDNA3.1-TPM1)质粒分别转染入细胞中，建立沉默(过表达)TPM1细胞。将U251和RR-U251细胞，分别以1×105个/mL的密度接种于6孔板中，无双抗培养液培养。待细胞汇合度约为80%时按试剂说明书的步骤进行转染，在荧光倒置显微镜下观察荧光强度及细胞数量，计算转染效率。继续培养转染成功的细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞增殖能力检测 用MTT法检测细胞增殖活力。各组细胞进行放射治疗，收集对数期细胞，调整细胞悬浮浓度，接种于96孔细胞培养板中，100 μL/孔。每组细胞设6个复孔，置于5% CO2、37 ℃孵育箱培养。培养48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃孵育。4 h后，弃去孔中培养液，拍干，每孔加入150 μL DMSO，小心震摇，使紫蓝色甲瓒结晶完全溶解；在酶联免疫检测仪上测定各孔的OD值，检测波长570 nm，计算细胞增殖活力[15]。

1.2.4 细胞迁移能力检测 采用划痕实验检测细胞的迁移能力。预先在6孔板背后用marker笔均匀划4条直线；将放射治疗后的处于对数期的各组细胞接种到6孔板中，每孔约为5×105个细胞。用无菌10 μL移液器吸头从汇合度约为80%～90%的细胞层上划过，划痕区域约为1～2 mm宽。D-Hanks液洗去悬浮细胞，清洗3次后，用无血清DMEM培养液培养。划痕0 h及24 h后在倒置显微镜下分别观察拍照，用ImageJ软件计算各组细胞 24 h内迁移面积的变化率。

1.2.5 细胞侵袭能力检测 采用Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。用无血清无双抗的DMEM培养液将Matrigel按1∶8比例稀释，吸取50 μL的Matrigel稀释液于Transwell的上室中，在37 ℃培养箱中放置2 h。收集经放射治疗后的各组细胞，用无血清DMEM培养液清洗3次，配制成密度为5×105个/mL的细胞悬液。用无血清DMEM培养液清洗Matrigel 1次。吸取100 μL的细胞悬液于Transwell上室中；吸取500 μL含有15%胎牛血清的DMEM培养液于Transwell下室中；在37 ℃，5% CO2培养箱中继续培养24 h。取出Transwell上室后用D-Hanks液清洗2遍，脱水醇固定30 min；用0.1%结晶紫染色上室30 min，D-Hanks液清洗2次，棉签擦去上室内细胞，在倒置荧光显微镜下观察，细胞计数。

1.2.6 细胞凋亡率检测 用流式细胞仪检测细胞的凋亡。收集对数期的各组细胞铺于25 mL的细胞培养瓶，1×106个/mL；用60Co γ射线照射10 min，剂量率和剂量分别为0.5 Gy、5 Gy。D-Hanks液清洗细胞2次后收集细胞；用D-Hanks液重悬细胞，调整为单细胞悬液，用75%冰乙醇固定。4℃过夜后，离心，弃上清液，重悬细胞，加入100 μL的PI及RnaseA混合液，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.7 TPM1蛋白表达检测 采用Western blot法。总蛋白的提取按照RIPA蛋白提取液说明书操作。用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，将所有蛋白样品调至等浓度(1～3 μg/μL)；灌制10%的SDS-PAGE胶，恒压100 V电泳分离蛋白样品。电泳后除去凝胶，将其浸入转移溶液中10 min，量取面积稍大于胶的PVDF膜，用甲醇浸湿，并浸入转移液中10 min。将膜和胶夹在上下3层滤纸之间，形成三明治夹心；压紧后置于半干转移槽中，1.25 mA/cm2恒流转移55 min。目的蛋白条带出现后，漂洗PVDF膜数次。转移后的PVDF膜置于5%脱脂奶粉中摇床上封闭2 h[16]，加入一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)孵育2 h。用ECL发光液试剂检测条带，化学发光成像仪和Gel Analysis软件进行数据分析。

2 结 果

2.1 U251与RR-U251细胞的TPM1蛋白水平比较 与U251细胞相比，RR-U251细胞的TPM1蛋白水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。结果表明TPM1与U251细胞的放射敏感性有关，放射抵抗细胞的TPM1蛋白表达水平明显下降。

2.2 沉默及过表达TPM1细胞系的建立 Western blot测定转染质粒后的TPM1蛋白表达水平显示，转染12 h后转染效率达到约55%(图2A)；shRNA-TPM1-Homo-614对TPM1表达的抑制效果好(图2B)，且在48 h抑制效果最好(图2C)，抑制率达到43.7%。转染shRNA-TPM1质粒(pcDNA3.1-TPM1质粒)48 h后明显降低(提高)U251细胞或RR-U251细胞的TPM1蛋白表达水平，差异有统计学意义(P<0.05-0.01)(图2D、E)。

2.3 TPM1联合放射治疗对细胞增殖能力的影响 放射治疗后，沉默TPM1的U251细胞的增殖能力升高21.02%，放射敏感性降低；过表达TPM1的U251细胞的增殖能力降低11.76%，放射敏感性增高；与U251细胞比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)(图3A)。同样放射治疗后，过表达TPM1的RR-U251细胞的增殖能力下降17.34%，沉默TPM1的RR-U251细胞的增殖能力升高22.28%；与RR-U251细胞比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)(图3B)。表明放射治疗后，TPM1可以抑制U251及RR-U251细胞的增殖，提高胶质瘤细胞的放射敏感性。

2.4 TPM1联合放射治疗对细胞迁移能力的影响 划痕的实验结果显示，放射治疗后，沉默TPM1的U251细胞的迁移能力增强33.66%，过表达TMP1的U251细胞的迁移能力减弱43.99%；与正常U251细胞比较，差异均有统计学意义(均P<0.001)(图4A)。放射治疗后，沉默TPM1的RR-U251细胞的迁移率与RR-U251细胞相比增强38.57%，过表达TPM1的RR-U251细胞的迁移能力降低54.42%；与RR-U251细胞相比，差异均有统计学意义(P<0.05-0.001)(图 4B)。表明放射治疗后，TPM1抑制U251和RR-U251细胞的迁移能力，TPM1能提高胶质瘤细胞的放射敏感性。

2.5 TPM1联合放射治疗对细胞侵袭能力的影响放射治疗后，沉默TPM1的U251细胞的侵袭能力增强42.86%，TPM1过表达的U251细胞的侵袭能力降低63.81%；与正常U251细胞比较，差异均有统计学意义(P<0.05-0.01)。同样放射治疗后，沉默TPM1的RR-U251细胞侵袭能力增强32.12%，过表达TPM1的RR-U251细胞的侵袭能力降低65.75%；与RR-U251细胞比较，差异均有统计学意义(P<0.05-0.01)(图5)。表明放射治疗后，过表达TPM1的U251及RR-U251细胞的侵袭力均下降，细胞的放射敏感性增加。

2.6 TPM1联合放射治疗对细胞凋亡能力的影响 放射治疗后，沉默TPM1的U251细胞的凋亡率下降48.67%(P<0.01)，过表达TPM1的U251细胞的凋亡率升高19.16%(P<0.05)；与正常U251细胞比较，差异均有统计学意义。放射治疗后，沉默TPM1的RR-U251细胞的凋亡率下降48.86%(P<0.01)；过表达TPM1的RR-U251细胞的凋亡率升高22.04%(P<0.05)；与RR-U251相比，差异均有统计学意义(图6)。表明放射治疗后，TPM1可以促进U251细胞与RR-U251细胞的凋亡，提高细胞的放射敏感性。

3 讨 论

近年来，脑肿瘤的发病率呈上升趋势，而脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤。放射治疗是肿瘤患者确诊后的主要治疗方式，与化疗相比全身的不良反应相对较少，具有局部控制肿瘤的优势。虽然放疗可以提高胶质瘤患者的生存率，但是由于胶质瘤细胞产生获得性的放射抵抗导致肿瘤复发和转移，使得放疗的疗效受到限制。放射线会直接造成细胞的DNA损伤，包括双链断裂、单链断裂以及DNA分子的交联等。DNA损伤后，DNA损伤应答(DNA-damage response，DDR)通过启动和协调DNA修复机制和激活细胞周期检验点，暂时阻滞细胞周期进展，修复损伤后的DNA，维持基因组的稳定性[16]。近几年研究发现，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活化产生的NADPH和Ru-5-P，可促进DNA损伤的修复；导致胶质瘤细胞产生放疗抵抗[17]。而抑制PTEN磷酸化可阻断DNA损伤修复，增强胶质瘤的放射敏感性[18]。如果在细胞周期停滞期间严重的DNA损伤不能被修复，就会激活与凋亡相关的信号通路诱导细胞凋亡。而Notch通路[19]、Wnt/β-catenin通路[20]、ATM/Chk2/p53通路[21]、STAT3通路[22]等与胶质瘤放射抵抗相关的信号通路被激活后，会抑制细胞的凋亡，促进胶质瘤细胞产生放射抵抗。

TPM1是一种与肌动蛋白结合的细胞骨架蛋白，在正常细胞的极性的维持、运动、转移等方面发挥着作用。研究表明，TPM1在肿瘤的发生发展中也发挥着重要的作用。在细胞恶性转化过程中，来自TPM1和TPM2的HMW异构体经常被下调或丢失，使得HMW的TPM受到持续的抑制。Prasad等首先报道了TPM1的表达在乳腺癌中下调，并作为肿瘤抑癌基因发挥作用[12]。随后的研究表明，在肝内胆管癌[23]、膀胱尿路上皮癌[24]、胃癌[25]、胶质瘤[14]中，TPM1的表达水平也呈下降趋势。以TPM1为代表的细胞关键骨架蛋白的下调，会促进肿瘤细胞的转移和侵袭。如miRNA-183-5p.1通过下调TPM1表达使Bcl-2/P53信号通路失活，促进胃癌细胞的迁移和侵袭[25]；丹参酮ⅡA通过下调由miR-21-5p介导的TPM1，来抑制血管平滑肌细胞的迁移[26]；在肾癌中TPM1可以抑制OSRC-2和786-O两种肾癌细胞系的迁移和侵袭[27]。本研究结果表明，与U251细胞相比，RR-U251细胞的TPM1蛋白表达水平显著降低。TPM1表达水平的改变会重塑细胞骨架，并影响肌动蛋白丝的稳定性及其组装动力学[28]。稳定聚合的肌动蛋白丝也被称为应力纤维，应力纤维对于细胞产生向前移动和向后收缩的力都是至关重要的。TPM1可诱导应力纤维产生，TPM1的N末端结构修饰会破坏应力纤维组织，从而影响细胞的形态、运动性和稳定性，消除TPM1的抑癌作用，导致细胞恶性转化[29]。然而，对TPM1介导的细胞骨架功能和肿瘤抑制的分子机制仍知之甚少。本研究首次探讨了TPM1与放射敏感性的关系。放射治疗后，沉默TPM1的U251细胞和RR-U251细胞的迁移和侵袭能力均显著提高。反之，过表达TPM1的U251细胞和RR-U251细胞的迁移和侵袭能力显著下降。结果表明，TPM1作为抑癌基因与胶质瘤的放射抵抗密切相关。

TPM1在细胞增殖和凋亡中也起着重要作用。正常膀胱尿路上皮细胞含有大量的TPM1和TPM2的HMW TPM异构体。如果DNA受损，TPM1通过与长链非编码RNA母系印记基因3(maternally expressed genes 3,MEG3)的协同作用，导致大部分细胞停滞在G0/G1期，处于G2/M期的细胞数量下降，促进细胞凋亡，抑制膀胱尿路上皮癌细胞的增殖[24]。也有文献报道，TPM1通过p53介导的线粒体途径抑制肾癌细胞的增殖，促进肾癌细胞凋亡[30-31]。TPM1的过表达也与口腔鳞状细胞癌[32]、胆管癌[23]凋亡率增高有关。本研究发现，放射治疗后上调TPM1可以抑制RR-U251和U251细胞的增殖，促进RR-U251和U251细胞的凋亡；而在沉默TPM1的细胞中，细胞的增殖率增高、凋亡率降低。因此，TPM1在胶质瘤的增殖和凋亡进程中起着重要的调控作用，与放射抵抗密切相关。

综上所述，放射治疗后，沉默TPM1基因可诱导人胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡，间接影响其对放射的敏感性；而过表达TPM1基因则可逆转这一现象。本研究结果初步揭示了TPM1在人胶质母细胞瘤细胞放射治疗中的重要作用；TPM1可能是改善胶质瘤放射敏感性的潜在靶点。但TPM1与放射抵抗的确切机制还有待进一步的研究证实。