葡萄籽原花青素对猪背最长肌肌苷酸和肌内脂肪含量的影响

张 楠，暴雪艳，郝瑞荣，李清宏

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

近年来，我国养猪业向集约化和规模化发展，畜牧养殖业中药物滥用已成为普遍现象，这些药物在动物体内蓄积形成药物残留和细菌耐药性[1]，原花青素是从植物中提取的活性成分，作为天然植物饲料添加剂已成为养殖业可持续发展的必然选择。原花青素具有抗氧化、降低血清胆固醇、肝脏胆固醇、甘油三酯的功能，能维持血浆中胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）的含量，改善血脂异常[2]，它是由不同数量的儿茶素、表儿茶素和没食子酸通过C4-C6或C4-C8键缩合而成的多聚体[3]。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSPs）是提取于葡萄籽中的一类植物源性多酚化合物。左晟希[4]通过试验发现，在AA肉鸡饲料中添加一定量的原花青素、茶多酚，能显著降低肌肉剪切力、提高肌肉干物质含量，改善肉质。汪水平等[5]研究表明，原花青素可降低兔肉肌肉组织的粗脂肪含量，改善兔肉肉品的物理性状。随着对原花青素研究的深入，人们逐渐重视起原花青素作为饲料添加剂对肉品质的影响，但在猪肉方面研究较少。

本试验通过在饲料中添加不同含量的葡萄籽原花青素，检测其与猪肉品质相关的肌苷酸（IMP）和肌内脂肪含量（IMF）的影响，及与IMP和IMF相关基因（腺苷酸琥珀酸裂解酶基因（ADSL）、腺苷-磷酸脱氨酶基因（AMPD1）、二酰基甘油转移酶1基因（DGAT1）、脂蛋白脂酶基因（LPL））的表达量，为葡萄籽原花青素在饲料中的添加量提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用猪为平均体质量在25 kg左右的杜×长×大三元杂交猪，共48头；供试葡萄籽原花青素（GSPs）（95%）含79.28%的低聚原花青素，购于天津尖峰天然产物研究开发有限公司；供试玉米-豆粕基础日粮参照NRC（2012）营养需要配制，日粮组成和营养成分含量列于表1。

表1 基础日粮组成及营养成分含量

主要仪器：高速冷冻离心机（德国，Eppendorf AG）；普通PCR扩增仪（美国，赛默飞世儿科技公司）；实时荧光定量PCR仪（美国，Stratagene）；超净工作台BCM-1000（苏州，苏信环境科技有限公司）；微量移液器（德国，Eppendorf AG）；超纯水制水仪（香港，力康生物医疗科技控股集团）；超低温冰箱（美国，赛默飞世儿科技公司）；电热恒温鼓风干燥箱（河北，北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 试验设计

猪随机分为4组：Ⅰ组.基础日粮（CK）；Ⅱ组.基础日粮+100 mg/kg GSPs；Ⅲ组.基础日粮＋150 mg/kg GSPs；Ⅳ组.基础日粮+200 mg/kg GSPs。每组3个重复，每个重复4头猪。饲养试验期间，试验猪自由采食和饮水，预先试验7 d，正式试验28 d，按照猪场常规管理程序进行驱虫和免疫。饲养试验结束后，禁食12 h，每个重复随机选取3头猪屠宰，取背最长肌、肝脏、心脏组织装入2 mL冻存管，迅速浸入液氮中，再转入-80℃冰箱，用于肌苷酸、肌内脂肪含量的测定和总RNA的提取。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 IMP含量 采用高效液相色谱法测定，流动相0.05 mol/L，pH＝6.5，甲酸铵溶液（含5%甲醇）；进样量10μL；流速0.8 mL/min；进样温度30℃。

1.3.2 IMF含量 采用索氏提取法（GB/T 5009.6—2003）测定。

1.3.3 IMP和IMP相关基因的检测

1.3.3.1 总RNA的提取与反转录 在无菌条件下提取RNA，用微量核酸蛋白检测仪进行浓度、纯度以及A260/A280（R值）的检测，质量好的RNA的R值在1.8～2.0，小于1.8说明有蛋白质污染，大于2.0说明RNA部分降解。按照Prime ScriptTMRT Rragent kit with gDNA Earser（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行操作，在无菌条件下反转录合成cDNA第1链。

1.3.3.2 引物的设计与合成 根据NCBI上已公布的ADSL、AMDP1、DGAT1、LPL和内参基因β-actin的序列，用Primer 3 Plus引物设计软件设计引物序列，由上海桑尼生物科技有限公司进行引物合成。引物序列及产物长度列于表2。

表2 目的基因与内参基因引物序列

1.3.3.3 实时荧光定量PCR反应体系的建立 按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，用反转录出的cDNA进行梯度PCR扩增，优化反应条件，选择引物最适退火温度和调整cDNA浓度。反应条件：95℃条件下预变性30 s；以95℃5 s、60℃30 s为循环条件进行40个循环反应。试验所用反应体系列于表3。

表3 实时荧光定量PCR反应体系

1.4 数据处理

采用2-ΔΔT法计算相对定量结果，所有数据均以SPSS17.0软件中的ANOVA程序进行单因素方差分析，以LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 GSPs对猪背最长肌中IMP和IMF含量的影响

表4 日粮添加GSPs对猪背最长肌中IMP和IMF含量的影响

从表4可以看出，与空白组相比，添加GSPs的3个试验组背最长肌中的IMP含量均极显著增加（P＜0.01），各组间差异显著（P＜0.05）；随着GSPs添加量的增加，IMP含量先增加后减少，其中，Ⅲ组IMP含量最高。与空白组相比，3个试验组背最长肌中的IMF含量极显著降低（P＜0.01），各组间差异极显著（P＜0.01）；随着GSPs添加量的增加，IMF含量先减少后增加再减少，其中，Ⅳ组IMF含量最少。

2.2 GSPs对猪背最长肌、肝脏和心脏中相关基因表达量的影响

各组猪背最长肌、肝脏和心脏中IMP的相关基因表达列于表5。从表5可以看出，与空白组相比，腺苷酸琥珀酸裂解酶基因（ADSL）在背最长肌中表达量降低，各组间差异极显著（P＜0.01），在添加GAPs的组中，Ⅲ组表达量最高；在肝脏中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的表达量差异不显著（P＞0.05），Ⅳ组表达量显著高于其他3组；在心脏中，各试验组表达量差异显著（P＜0.05），其中，Ⅳ组极显著高于其他组，Ⅲ组极显著低于其他组。与空白组相比，腺苷-磷酸脱氨酶基因（AMPD1）在背最长肌的表达量极显著降低（P＜0.01），Ⅳ组表达量显著低于其他3组，Ⅱ、Ⅲ组间差异不显著，Ⅰ组和Ⅳ组与Ⅱ、Ⅲ组间差异显著（P＜0.05）；在肝脏中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的表达量差异不显著（P＞0.05），Ⅰ、Ⅳ组的表达量差异不显著，Ⅳ组表达量显著高于Ⅱ、Ⅲ组；在心脏中，Ⅰ、Ⅱ组的表达量均显著高于Ⅲ组和Ⅳ组（P＜0.05），其中，Ⅱ组表达量极显著高于其他组（P＜0.01）。

表5 猪背最长肌、肝脏和心脏中IMP相关基因表达

各组猪背最长肌、肝脏和心脏中IMF的相关基因表达列于表6。从表6可以看出，二酰基甘油转移酶1基因（DGAT1）mRNA的表达量在背最长肌中随GSPs添加量的增加而减少，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间表达量差异不显著（P＞0.05），Ⅳ组表达量显著低于Ⅰ、Ⅱ组（P＜0.05），虽然也低于Ⅲ组但差异不显著；在肝脏中，Ⅰ、Ⅳ组间表达量差异不显著，与其他2组相比，表达量差异极显著（P＜0.01），Ⅱ组表达量极显著高于其他组，Ⅲ组表达量极显著低于其他组（P＜0.01）；在心脏中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组间表达量差异不显著，Ⅲ组表达量显著低于其他组（P＜0.05）。LPL mRNA的表达量在背最长肌中Ⅰ、Ⅱ组间差异不显著，Ⅲ组表达量极显著高于Ⅰ、Ⅳ组（P＜0.01）；Ⅳ组表达量极显著低于Ⅱ、Ⅲ组；在肝脏中，Ⅱ组表达量低于Ⅰ、Ⅳ组，但与Ⅲ组间差异不显著，Ⅳ组表达量显著高于其他组（P＜0.05）；在心脏中，Ⅱ、Ⅲ组间差异不显著，Ⅰ、Ⅳ组间差异不显著，但Ⅱ、Ⅲ组的表达量显著低于Ⅰ、Ⅳ组。

表6 猪背最长肌、肝脏和心脏中IMF相关基因表达

3 讨论

3.1 GSPs对猪背最长肌IMP含量及心脏、肝脏中相关基因表达量的影响

人们研究发现，多肽类和核苷酸是肉类和肉制品鲜味的主要来源，其中，肌苷酸（IMP）是最强的鲜味物质，已成为评定肉质鲜美的重要指标[6]。IMP在体内有着十分复杂的代谢过程，这其中有10种关键酶的参与。腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）主要催化AMP合成的由SACIAR生成AICAR的反应和由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应，ADSL基因的表达可调控IMP含量[7]。腺苷-磷酸脱氨酶（AMPD1）催化AMP脱氨生成IMP。肌苷酸的含量受动物的品种、饲料、饲养环境、屠宰时间、肌肉酸碱度、屠宰后处理等因素的影响[8-10]。

曹少奇等[11]对巨型玫瑰冠鸡的研究表明，ADSL基因的表达与IMP含量显著相关，它的高表达可提升IMP含量。STRATIL等[12]研究报道，AMDP1基因定位于猪与肉质胴体性状相关的QTL位点上，可将其作为猪胴体性状的候选基因研究。本试验结果显示，在日粮中添加GSPs的各组背最长肌中IMP的含量显著增加，在添加量为150 mg/kg的组中IMP含量高于其他组。以空白组为对照，ADSL基因的mRNA表达量在背最长肌中添加GSPs的组中显著低于空白组，添加量为100 mg/kg的组表达量显著低于其他组，在肝脏和心脏中GSPs添加量为200 mg/kg时表达量显著高于其他组；AMDP1基因的mRNA表达量在背最长肌中添加GSPs的组中同样极显著低于空白组，添加量为200 mg/kg的组表达量显著低于其他组，但在肝脏中200 mg/kg添加量的组表达量最高，在心脏中100 mg/kg添加量的组表达量极显著高于其他组。这说明在日粮中适量添加GSPs有助于肌肉中IMP含量的增加，同时，添加浓度的不同对IMP相关基因在不同组织中的表达量影响各异。

3.2 GSPs对猪背最长肌IMF含量及心脏、肝脏中相关基因表达量的影响

肌内脂肪（IMF）是沉积于肌肉组织的白色脂肪，由肌内脂肪组织和肌纤维中的脂肪组成。IMF的含量主要影响肉的嫩度、大理石纹评分、滴水损失，IMF含量越高，脂肪含量越多，肉的嫩度越好，大理石纹评分升高，对滴水损失也有一定的保护[13-14]。二酰基甘油转移酶1（DGAT1）是甘油三酯合成过程中的唯一关键酶，催化脂肪细胞甘油三酯合成反应的最后一步。国内外学者对牛的DGAT1基因遗传多态性研究较多，有研究表明，德国荷斯坦牛和夏洛莱牛的背最长肌和半肌腱中的肌内脂肪与K232A变异位点显著相关[15]。脂蛋白脂酶（LPL）能将极低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯催化水解为脂肪酸，以供各组织储存利用。除游离脂肪酸与血清蛋白结合形成可溶性复合物在血液中运输以外，其余都是以脂蛋白形式在血液中运输，LPL对脂肪运输有重要的调节作用，其活性高低是脂肪沉积的重要指标[16]。有研究表明，莱芜黑猪LPL mRNA的高表达对肌内脂肪含量增加有积极的影响[17]。本试验结果显示，与空白组相比，在日粮中添加GSPs的各组背最长肌中IMF的含量极显著降低，在添加量为150 mg/kg的组中IMF含量高于其他添加组。以空白组为对照，DGAT1基因的mRNA表达量在背最长肌中添加GSPs的组中低于空白组，添加量为200 mg/kg的组表达量最低，在肝脏和心脏中GSPs添加量为150 mg/kg时表达量显著低于其他组；LPL基因的mRNA表达量在背最长肌中GSPs添加量为200 mg/kg的组中显著低于其他组，但在肝脏中200 mg/kg添加量的组表达量显著高于其他组，在心脏中100 mg/kg添加量的组表达量最低。这说明在日粮中添加GSPs会减少肌肉中IMF的含量，同时，对IMF相关基因在不同组织的表达量上有一定的影响。马蕾等[18]研究表明，山楂原花青素对高脂饮食诱导的肥胖小鼠具有降脂作用。李德鹏等[19]研究表明，GSPs对绵羊脂肪细胞的生脂过程具有抑制作用，对前脂肪细胞的分化具有抑制作用。以上研究从不同方面说明了原花青素有降低动物体内脂肪含量的作用，与本试验结果类似，在本试验中，GSPs对IMF相关基因mRNA的表达量有一定的影响，但趋势并不完全一致。在后续试验中可对GSPs影响IMF含量的机制做进一步研究。

4 结论

GSPs因具有抗氧化性、清除自由基、提高免疫力等作用而大受人们关注，作为天然添加剂在饲料中有广泛的应用前景。本试验结果表明，在生长猪日粮种添加GSPs，有效提高了猪背最长肌中IMP的含量，降低了IMF的含量，并发现日粮中GSPs添加量为150 mg/kg较为合理，此时，IMP含量最高，IMF含量适中；对IMP、IMF相关基因的表达量也有明显的影响，但作用机制尚未明确，需做进一步的研究。