不同分子指标鉴定四川雅江鸡蛋菌的差异

石家祺，渠文思，周桂旭，崔金龙，石亚伟

（1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特010018；2.山西大学生物技术研究所，教育部化学生物学与分子工程重点实验室，山西太原030006；3.山西大学应用化学研究所，山西太原030006）

鸡蛋菌又称为鹅蛋菌、黄罗伞等，为云贵川地区对可食用的一大类鹅膏菌的俗称，其因黄色、橙色或橙红色扁球形菌盖被囊状、球状或近球状的白色菌托包裹，形似煮熟的鸡蛋或鹅蛋而得名，其可能包括红黄鹅膏菌、黄蜡鹅膏菌、黄褐鹅膏菌和拟橙盖鹅膏菌等几种类型。鹅膏菌属于真菌界担子菌门鹅膏科鹅膏属[1]，是深受人们喜爱的食用菌，但形态上常常与一些有毒的鹅膏菌混淆，比如黄盖鹅膏原变种等。有毒的鹅膏菌含有两大类毒素，即肽类毒素和非肽类毒素，其中，最重要的是肽类毒素，其包括毒伞素、鬼笔毒肽和鹅膏毒肽[2]，这3类多肽毒素都是环肽化合物，化学结构稳定、耐高温、耐干燥和耐酸碱，一般煮沸都不能改变其结构，进入人体后对肾脏和肝脏都有极强的破坏作用[3]，鹅膏菌中的毒肽能专一性抑制真核细胞RNA聚合酶II[4-5]，导致人中毒死亡。

真菌种类繁多，分布范围广，在农业、食品和生物医药等行业都具有重要的作用，所以对于真菌菌株的分类、鉴定非常必要[6]。传统的真菌分类主要是通过观察真菌生长的地理环境、形态特征以及孢子的形态特征等形态学指标进行鉴定[7]。该方式费时费力，人为误差较大，往往鉴定结果准确度不高；而且一些形态相似、生长条件特殊的菌株仅通过传统方法容易鉴定错误，例如曾经将东亚的红黄鹅膏菌（Amanita hemibapha）误定为欧洲的白橙盖鹅膏菌（Amanita caesarea）[8]。随着分子生物学的快速发展，DNA序列分子已经被广泛应用于真菌的系统学研究中[9-10]。DNA序列分析已经从最初的以核糖体DNA（rDNA）作为分子标记，发展到目前新型的分子标记如β-tubulin（β-微管蛋白）、RPB2（RNA polymeraseII RNA聚 合 酶2）、EFI-α（Eukaryotic Translation Elongation Factor 1A翻译延伸因子1A）等蛋白编码序列[11]。

本试验结合形态学观察和分子生物学方法，对采自四川雅江的一株鸡蛋菌，通过ITS（Internal Transcribed Spacer内转录间隔序列）、LSU（Large Subunit大亚基序列）、RPB2、β-tubulin和EFI-a的不同DNA区段进行分类鉴定比较，旨在提供一种简单易行、准确度高的鸡蛋菌鉴定方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试鸡蛋菌的子实体采自四川省雅江县，新鲜子实体采集后去除泥沙等杂物，置于-80℃冰箱保藏。

1.1.2 主要试剂 DNA纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自上海百研生物科技有限公司；FastPfu DNA聚合酶PCR扩增所用试剂以及EASY-Blunt3 Cloning Kit购自北京全式金科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡蛋菌子实体基因组DNA的提取及检测用灭菌镊子撕去菌盖的外表皮，挑选含有菌褶的菌盖部分，采用SDS-CTAB法[12]提取基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。

1.2.2 鸡蛋菌ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α基因序列的PCR扩增 PCR扩增鸡蛋菌子实体ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α序列，引物分别使用组合ITS1/ITS4、LROR/LR5[13]、Am-6F/Am-7R、Am-β-tubulinF/Am-β-tubulinR[14]和983F/1567R[15]，具体序列列于表1。

DNA序列的PCR扩增总体积为25μL，反应体系为：10×Easy Taq Buffer 2.5μL，10 mmol/L dNTP 2μL，10μmol/L Forward primer引物和10 mmol/L Reverse primer引物各2.5μL，Taq DNA Polymerase 0.5μL，去离子H2O 13μL，DNA模板2μL。扩增反应在美国MJResearch公司的PCR仪上进行，扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，72℃保温10min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，采用上海复日科技有限公司的凝胶成像系统照相。

1.2.3 ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α片段的克隆和测序 从1%的琼脂糖凝胶上切胶回收ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α的相应DNA片段，分别连接到pEASY-Blunt3 Cloning Kit载体上，转化到Trans1-T1感受态细胞中，通过蓝白筛选，挑取白色菌落，利用通用引物M13F/M13R进行菌落PCR筛选，并将阳性重组子送至北京六合华大基因生物技术有限公司进行DNA测序。

1.2.4 ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α序列比较和系统发育树构建 用MEGA（version 5.1）软件中的最大似然法进行系统发育树的构建和分析，选择系统发育树中的自展值（bootstrap）为1 000次。

2 结果与分析

2.1 对鹅膏菌子实体不同DNA片段PCR扩增及测序结果

以提取的鸡蛋菌子实体的基因组DNA为模板，利用不同的引物组合对编码ITS、LSU、RPB2、βtubulin和EFI-α等的片段进行PCR扩增，结果如图1所示，符合预期长度ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α的5个不同的片段均能够扩增出清晰的条带。

2.2 鸡蛋菌子实体ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α的DNA片段测序及序列分析结果

从表2可以看出，四川雅江鹅膏菌的ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-αDNA序列长度分别为645、968、807、478、608 bp；GC含量分别为42.33%、48.35%、50.56%、48.95%和49.51%。将鸡蛋菌子实体PCR扩增得到的rDNA ITS和LSU序列与NCBI的GenBank数据库进行检索比对，得到ITS、LSU序列的最相似物种为肉桂鹅膏菌（Amanita cinnamomescens）；以RPB2、β-tubulin和EFI-α序列为基础进行比对，则得到最相似物种均是红黄鹅膏黄褐变种（Amanita hemibapha var.ochracea）。

表2 鸡蛋菌子实体的ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α的测序结果分析

2.3 系统发育树结果分析

从图2～3可以看出，将子实体的ITS和LSU序列以及GenBank数据库上下载的7个相似物种序列通过最大似然法构建系统发育树，结果显示，四川雅江鹅膏菌分别以99%和96%较高的支持率与其最相似物种肉桂鹅膏菌（GenBank：KP284286）和肉桂鹅膏菌（GenBank：KF877222）聚在一起。

由图4～6可知，以子实体的RPB2、β-tubulin和EFI-α序列以及GenBank数据库上下载的7个相似物种序列通过最大似然法构建系统发育树，结果显示，四川雅江鸡蛋菌分别与其最相似物种Amanita hemibapha var.ochracea（GenBank：KF877063）、Amanita hemibapha var.ochrace a（GenBank：MF440385）和 Amanita hemibapha var.ochracea（GenBank：KF877135）聚在一起，以3种蛋白编码的序列构建系统发育树结果显示，均以98%的支持率与红黄鹅膏黄褐变种聚为一类。

3 结论与讨论

核糖体DNA是编码核糖体的RNA基因，rDNA的ITS通常包括ITS1、5.8S和ITS2之间的转录内间隔区，nLSU是位于28S的RNA序列，rDNA的ITS和nLSU序列经常用于植物和真菌的分类学、系统学研究[16-17]。利用ITS和LSU序列分子指标在亲缘关系较近的物种间分类时，存在较低的分辨率[18]。本研究单依赖于ITS和LSU这2个经典的分子指标聚类鉴定为肉桂鹅膏菌；但结合鸡蛋菌的形态观察，本研究在鉴定中引入RPB2、β-tubulin和EFI-α分子指标进一步鉴定为红黄鹅膏黄褐变种（Amanita hemibapha var.ochracea）。杨祝良[1]将我国鹅膏属分为2个亚属和7个组，其中，红黄鹅膏归为鹅膏亚属（Subgenus Amanita）橙盖鹅膏组（Section Amanita），别名橙红鹅膏、花柄橙红鹅膏；红黄鹅膏又分为4个亚种：红黄鹅膏原亚种（Amanita hemibapha subsp.hemibapha）、红黄鹅膏黄色亚种（Aanaita hemibapha subsp.javanica）、红黄鹅膏暗褐亚种（Amanita hemibapha subsp.similis）、红黄鹅膏黄褐变种（Amanita hemibapha var.ochracea），其中，红黄鹅膏黄褐变种主要特征是担子果多大型，菌盖褶色至黄色，中央有明显的褐色凸起，边缘有长棱纹；菌褶白色，偶浅黄色；菌柄被为黄褐色至黄色的蛇皮状鳞片，菌幕残余（菌托）袋状，白色，主要分布在我国，在湖南、四川、云南等地都有发现。而通过ITS和LSU序列鉴定的肉桂鹅膏菌（Amanita cinnamomescens）最初来源于巴基斯坦和尼泊尔等地，尚未有更多分子及形态的信息。总之，结合形态学观察和多个分子鉴定指标，来自四川雅江一株鸡蛋菌应该是红黄鹅膏黄褐变种（Amanita hemibapha var.ochracea）。对于真菌鉴定中，特别是种间或形态指标非常接近时，引入RPB2、β-tubulin和EFI-α等分子指标，对真菌物种的准确鉴定不失是一个有益的方法。