脂联素抑制β11-肾上腺素受体自身抗体诱导的大鼠H9c2心肌细胞自噬流下降*

孙 聪， 郭 帅， 宁 娜， 侯晓鸿， 王昌图， 原 媛， 王晓晖，， 王 丽△

（山西医科大学基础医学院 1病理学教研室，2形态学实验室，山西太原030001）

心功能不全是多种心脏疾病的终末阶段，是重要的全球公共健康问题，但发病机制尚未完全阐明［1］。有证据表明，心肌细胞死亡是心功能不全发生发展的关键因素［2］。β1-肾上腺素受体自身抗体（β1-adrenergic receptor antibody，β1-AA）可以诱导心肌细胞死亡［3］。自身抗体是指针对人体自身抗原产生的抗体［4］，而β1-AA是针对β1-肾上腺素受体细胞外第2环（the second extracellular loop ofβ1-adrenergic receptor，β1-AR-ECII）产生的抗体［3］。约 40%～60%心功能不全患者血清中均可检测到β1-AA［5］，其与心肌细胞膜表面β1-AR-ECII结合发挥类激动剂样作用，引起心肌细胞持续性损伤，导致心肌细胞死亡［3］，提示β1-AA诱导的心肌细胞死亡在心功能不全的发生发展中起重要作用。

自噬是细胞内重要的稳态调节机制，自噬流降低可引起细胞内有害蛋白的累积，进而导致细胞死亡［6］。我们课题组前期结果表明，心肌自噬流降低是β1-AA诱导心肌细胞死亡的重要原因，采用自噬激动剂上调心肌细胞自噬流可抑制β1-AA诱导的心肌细胞死亡［7］。因此，逆转β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降成为有效抑制心肌细胞死亡的切入点。

脂联素（adiponectin，APN）可与细胞膜表面脂联素受体（adiponectin receptor，AdipoR）结合，使下游AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）磷酸化，进而上调心肌细胞自噬流［8-9］。APN作为脂肪细胞分泌的细胞因子可增加心肌细胞存活率［10］。然而APN对于β1-AA诱导的心肌细胞死亡及自噬流下降是否具有抑制作用，目前尚无文献报道。因此，本实验拟通过体外研究，观察APN是否可以抑制β1-AA诱导的大鼠心肌细胞自噬流下降，并利用抑制剂干预AMPK磷酸化水平，从分子水平探讨APN调控自噬的可能机制，为β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降的调控提供实验基础。

材料和方法

1 动物和细胞

实验动物：清洁级8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重180～200 g，山西医科大学动物中心［许可证号：SCXK（晋）2015-0001］提供。实验细胞：H9c2大鼠心肌细胞（中国科学院上海细胞库）。

2 主要试剂

β1-AR-ECII抗原肽段（吉尔生化上海有限公司）；完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂（Sigma-Aldrich）；重组鼠 APN球状结构域 gAcrp30（PeproTech）；LC3B和P62抗体（Abcam）；AMPK和p-AMPK抗体（Cell Signaling Technology）；Compound C（Selleck）；GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的小鼠IgG（中杉金桥生物公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8；日本同仁化学研究所）；SYBR Green试剂盒（TaKaRa）。

3 主要方法

3.1 实验分组 将H9c2细胞分为对照（control）组（1μmol/L阴性IgG处理细胞24 h）、β1-AA组（1μmol/Lβ1-AA处理细胞 24 h）、APN+β1-AA组（10μg/L APN预处理细胞1 h后加入1μmol/Lβ1-AA处理24 h）、APN组（10μg/L APN处理细胞25 h）、Compound C+APN+β1-AA组（20μmol/L Compound C预处理细胞30 min后加入10μg/L APN预处理1 h，最后加入1μmol/Lβ1-AA处理细胞24 h）和β1-AA+Compound C组（20μmol/L Compound C预处理细胞30 min后加入1μmol/Lβ1-AA作用24 h）。

3.2 主动免疫大鼠 选取12只8周龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为免疫（β1-AR-ECII）组和control组，每组6只。将β1-AR-ECII抗原肽段用Na2CO3溶液溶解稀释，并和完全弗氏佐剂1∶1乳化混匀后，多点背部皮下注射（0.4μg/g），即首次免疫。随后采用已稀释的β1-AR-ECII抗原肽段与不完全弗氏佐剂1∶1乳化，单点背部皮下注射，每隔2周加强免疫1次，共免疫8周；control组用等量Na2CO3溶液替代抗原溶液，实验方案同免疫组。

3.3 亲和层析法提纯大鼠血清中β1-AA 采用亲和层析法提纯主动免疫大鼠血清中的β1-AA，应用于离体实验研究。从4°C取出层析柱在室温下放置30 min，将三蒸水注入层析柱内部，冲去保存在柱子中的乙醇，用结合缓冲液冲洗柱子后，抽取含有β1-AA的血清滤过柱子并用洗脱缓冲液冲洗柱子，使β1-AA随同洗脱缓冲液滴到EP管中，随后用BCA试剂盒进行浓度检测。

3.4 CCK-8实验 本实验采用CCK-8法检测H9c2细胞活力。将细胞进行消化后，大约2×109/L的密度将细胞接种在96孔培养板，每孔100μL细胞悬液，待细胞贴壁后换液，加入5、10和30μg/L APN预处理1 h，随后加入1μmol/Lβ1-AA作用24 h后，每孔加入10μL CCK-8试剂混匀，放入孵箱中2 h，观察到溶液颜色变为棕黄色时，用酶标仪检测在450 nm处各组吸光度（A）值。根据各组的A值计算各实验组相较于对照组的细胞活力。细胞相对活力（%）=（实验组A值-空白对照组A值）/（阴性对照组A值-空白对照组A值）×100%。

3.5 real-time PCR 本实验采用real-time PCR方法检测beclin-1和LC3B的mRNA水平。将细胞进行消化，接种于6孔板中，细胞贴壁后，进行相应预处理，首先采用500μL的PBS进行冲洗，将PBS倒掉并用移液枪将残余的PBS吸净，然后向每孔细胞中加入500μL的TRIzol试剂进行裂解，提取总RNA，0.5μg总RNA反转录为cDNA，选用SYBR Green试剂盒扩增cDNA产物，确认扩增曲线和溶解曲线。引物序列如下：beclin-1（GenBank ID：NM_001034117.1）的上游引物序列为5′-GAAACTGGACACGAGCTTCAAGA-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-ACCATCCTGGCGAGTTTCAATA-3′；LC3B（GenBank ID： NM_022867.2）的 上 游 引 物 序 列 为 5′-AGCTCTGAAGGCAACAGCAACA-3′，下游引物序列为 5′-GCTCCATGCAGGTAGCAGGAA-3′；GAPDH（Gen-Bank ID：NM_017008.3）的上游引物序列为 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列为 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。 选 用GAPDH作为内参照。结果采用2-ΔΔCt法进行计算。

3.6 Western blot 本实验采用Western blot方法检测LC3B、P62、AMPK和p-AMPK的蛋白表达水平。将细胞进行消化，接种于6孔板中，待细胞贴壁，进行相应预处理后，向每孔细胞中加入50μL RIPA裂解液、0.5μL PMSF和0.5μL磷酸酶抑制剂。冰上裂解1 h，收取细胞样品，离心后取上清，进行BCA法蛋白浓度检测。选择上样量为40μg，体系为10μL，进行SDS-PAGE分离后，用PVDF膜转膜。再与相应的Ⅰ抗进行反应，4°C过夜，用TBST进行洗膜，与相应的Ⅱ抗在室温下进行反应，用TBST洗膜后，将膜置于全自动曝光仪内，ECL化学发光后，曝光拍摄条带，ImageJ软件分析灰度值，将GAPDH作为内参照，计算不同蛋白的相对表达量。

4 统计学处理

实验数据以均数±标准误（mean±SEM）表示，采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 APN抑制β1-AA诱导的H9c2细胞活力下降

CCK-8结果显示，与control组相比，β1-AA诱导心肌细胞活力显著下降（P＜0.05），10μg/L APN可显著逆转β1-AA诱导的心肌细胞活力下降（P＜0.05），5 μg/L和30μg/L APN均不能恢复β1-AA诱导的心肌细胞活力下降（P＞0.05），见图1。因此本研究选择10μg/L为APN的浓度进行后续实验研究。

Figure 1.Adiponectin（APN）inhibited the decrease in viability of the H9c2 cells induced byβ1-AA.The H9c2 cells was pretreated with APN（5，10 and 30μg/L）for 1 h before addingβ1-AA（1μmol/L），and CCK-8 assay was performed to measure cell viability.Mean±SEM.n=12.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vsβ1-AA group.图1 APN抑制β1-AA诱导的H9c2细胞活力下降

2 β1-AA诱导H9c2细胞自噬流下降

real-time PCR结果显示，与control组相比，β1-AA诱导beclin-1和LC3B的mRNA水平显著降低（P＜0.05），见图2A；Western blot结果显示，与control组相比，β1-AA诱导LC3-II蛋白水平显著降低（P＜0.05），P62蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图2B。

3 APN抑制β1-AA诱导的H9c2细胞自噬流下降

real-time PCR结果显示，与β1-AA组相比，APN显著上调beclin-1和LC3B的mRNA水平（P＜0.05），见图3A；Western blot结果显示，与β1-AA组相比，APN预处理可以显著逆转β1-AA诱导的LC3-II蛋白水平下降（P＜0.05）及 P62蛋白累积（P＜0.05），见 图3B。

Figure 2. β1-AA induced the decrease in autophagic flux of the H9c2 cells.A：the mRNA expression of beclin-1 and LC3B in the H9c2 cells was detected after treatment withβ1-AA（1μmol/L）for 24 h；B：the protein levels of LC3-I，LC3-IIand P62 in the H9c2 cells were measured after treatment with β1-AA（1 μmol/L）for 24 h.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group.图2 β1-AA诱导H9c2细胞自噬流下降

Figure 3. Adiponectin（APN）inhibited the decrease in autophagic flux of the H9c2 cells induced byβ1-AA.A：the mRNA expression of beclin-1 and LC3Bin the H9c2 cells was measured after pretreatment with APN（10μg/L）for 1 h before addingβ1-AA（1μmol/L）；B：the protein levels of LC3-I，LC3-II and P62 in the H9c2 cells were detected after pretreatment with APN（10 μg/L）for 1 h before adding β1-AA（1 μmol/L）.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vsβ1-AA group.图3 APN抑制β1-AA诱导的H9c2细胞自噬流下降

4 APN抑制β1-AA诱导的H9c2细胞AMPK磷酸化水平下降

Western blot结果显示，与 control组相比，β1-AA显著降低心肌细胞AMPK的磷酸化水平（P＜0.05），而与β1-AA组相比，APN预处理可显著改善β1-AA诱导的心肌细胞AMPK磷酸化水平下降（P＜0.05），见图4。

5 APN抑制β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降部分依赖AMPK途径

Figure 4.Adiponectin（APN）inhibited the decrease in phosphorylation of AMPK induced byβ1-AA in the H9c2 cells.The protein levels of p-AMPK and AMPK were determined by Western blot.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vsβ1-AA group.图4 APN抑制β1-AA诱导的H9c2细胞AMPK磷酸化水平下降

real-time PCR结果显示，与β1-AA组相比，APN预处理（APN+β1-AA组）可显著逆转β1-AA诱导的beclin-1和LC3B mRNA水平降低（P＜0.05）；而Compound C预处理（Compound C+β1-AA组）可进一步降低β1-AA诱导的beclin-1和LC3B mRNA水平（P＜0.05）；当应用Compound C和APN预处理（Compound C+APN+β1-AA组），APN则不能逆转β1-AA诱导的beclin-1和LC3B mRNA水平降低（P＜0.05），见图5A。Western blot结果显示，与β1-AA组相比，APN+β1-AA组AMPK磷酸化水平显著升高（P＜0.05）；而 Compound C+β1-AA 组和 Compound C+APN+β1-AA组AMPK磷酸化水平显著降低（P＜0.05），见图5B。进一步检测自噬流，APN+β1-AA组与β1-AA组相比，LC3-II蛋白水平升高，P62蛋白水平下降（P＜0.05）；Compound C+β1-AA组与β1-AA组相比，LC3-II蛋白水平降低（P＜0.05），P62蛋白表达升高（P＜0.05）；而Compound C+APN+β1-AA组LC3-II和P62蛋白水平均显著下降（P＜0.05），即LC3-II的降低无法被APN逆转，但P62的累积仍可被APN抑制，见图5B。

讨 论

心功能不全是全球公共健康问题，患病率和死亡率居高不下［11］。有证据表明，心肌细胞死亡是心功能不全发生发展的关键因素［2］。β1-AA可以与心肌细胞膜表面的β1-AR-ECII结合，导致细胞内环磷酸腺苷累积，影响细胞内Ca2+稳态，进而引起心肌细胞死亡［12］。我们课题组前期研究也表明，β1-AA可导致H9c2心肌细胞活力降低［13］。然而β1-AA如何导致心肌细胞死亡尚不清楚。

研究表明，自噬通过降解细胞内受损、变性及衰老的蛋白质和细胞器实现能量的循环利用，进而维持细胞自身稳态［6］。Miceli等［14］报道，单胺氧化酶通过产生过氧化氢引起氧化应激，诱导H9c2心肌细胞自噬流下降，导致自噬-溶酶体系统清除受损线粒体的能力下降，进而引发细胞内能量代谢紊乱，诱导心肌细胞死亡，提示自噬流降低可能参与H9c2心肌细胞死亡。我们课题组之前的研究结果表明，β1-AA可诱导H9c2细胞自噬流下降，上调心肌自噬流可抑制β1-AA诱导的心肌细胞活力下降，抑制心肌自噬流可导致β1-AA诱导的细胞活力进一步下降［7］，提示自噬流降低参与β1-AA诱导的心肌细胞死亡。因此逆转心肌细胞自噬流下降可能有助于抑制β1-AA诱导的心肌细胞死亡。

APN与自噬流密切相关［15］。APN是由脂肪细胞分泌的30 kD的细胞因子［15］，具有广泛的心肌细胞保护作用［10］。APN基因敲除小鼠存在严重的心肌自噬流受损，具体表现为自噬小体的生成及清除减少［16］，提示APN缺乏可诱导心肌自噬流显著下降。Ahlstrom等［17］报道，在高糖诱导的大鼠骨骼肌细胞中存在自噬流下降，而外源性给予APN可上调骨骼肌细胞自噬流，表明在离体水平APN可抑制骨骼肌细胞自噬流下降。为了证实APN对于β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降是否具有抑制作用，我们首先采用CCK-8法检测各组细胞活力，结果表明，APN可有效逆转β1-AA诱导的心肌细胞活力下降。随后我们进一步采用real-time PCR和Western blot检测各组自噬相关蛋白beclin-1、LC3B和P62的表达水平。beclin-1、LC3B和P62为检测自噬水平的常用指标，其中beclin-1代表自噬的起始，在自噬前体和自噬囊泡的形成过程中起着重要作用［18］；LC3B包括LC3-I和LC3-II，LC3-I与脑磷酯结合酯化形成 LC3-II，LC3-II最终定位于成熟的自噬小体膜上，其与自噬小体数量呈正相关［19］；P62蛋白是一种选择性自噬底物，当P62蛋白表达增加，表明自噬底物累积，自噬小体清除减少，自噬流降低［19］。本研究结果显示，APN可抑制β1-AA诱导的心肌细胞beclin-1和LC3B mRNA表达下降、LC3-II蛋白水平下降及P62蛋白累积。这提示APN对于β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降具有抑制作用，但具体机制尚不明确。

Figure 5.Adiponectin improved the decreased autophagic flux induced byβ1-AA partially dependent in AMPK signaling.A：the mRNA expressions of beclin-1 and LC3Bwere observed pretreatment with Compound C，adiponectin，or Compound C+adiponectin before addingβ1-AA.B：the protein expressions of P-AMPK，AMPK，LC3 I，LC3 IIand P62 were detected pretreatment with Compound C，adiponectin，or Compound C+adiponectin before adding β1-AA.Means±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vsβ1-AA group.图5 APN改善β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降部分依赖AMPK途径

研究表明，APN可通过AMPK途径上调自噬流［20］。AMPK是细胞能量感知和信号调控的重要激酶，对自噬流起着正向调节作用［21］。APN通过与细胞膜表面AdipoR结合，降低细胞内ATP含量，诱导AMPK磷酸化，活化下游Unc-51样自噬激活激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）激酶复合物；ULK1是自噬起始的重要激酶复合物，其通过磷酸化beclin-1，进而启动自噬；由此可见，APN可通过AMPK-ULK1途径上调细胞自噬流［20-22］。本研究结果表明，β1-AA可诱导H9c2心肌细胞AMPK磷酸化水平下降，而APN可逆转这一现象。为了进一步证明APN是否通过上调AMPK磷酸化而抑制β1-AA诱导的自噬流下降，我们采用AMPK的抑制剂Compound C抑制AMPK的磷酸化及AMPK介导的自噬激活作用［23］。本研究结果显示，Compound C预处理后，APN无法逆转β1-AA诱导的心肌细胞AMPK磷酸化水平下降，并且自噬流检测结果表明APN也无法逆转β1-AA诱导的LC3B和beclin-1 mRNA及LC3-II蛋白水平的降低，提示APN抑制β1-AA诱导的自噬小体生成降低依赖AMPK途径。同时我们观察到无论是否抑制AMPK的磷酸化作用，APN均可抑制P62蛋白的累积，即可增加自噬小体的清除，提示APN抑制β1-AA诱导的自噬小体清除降低不依赖AMPK途径。上述具体机制尚需进一步探讨。

综上所述，本研究采用β1-AR-ECII主动免疫大鼠血清中提纯的β1-AA作用于H9c2心肌细胞，并外源性给予APN，证实APN可抑制β1-AA诱导的心肌细胞死亡及自噬流降低；同时观察到APN可逆转β1-AA诱导的心肌细胞AMPK磷酸化水平降低；采用Compound C抑制AMPK磷酸化作用后，APN不能抑制β1-AA诱导的自噬小体生成降低，但仍可抑制β1-AA诱导的自噬小体清除降低，提示APN抑制β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降部分依赖AMPK途径。