蛋白磷酸酶4在棕榈酸降低人脐静脉内皮细胞eNOSSer633位点磷酸化中的作用*

秦 思，张 倩，王敬杰， 于 敏， 骆妍蓓， 丁 菁， 陆德琴

（贵州医科大学病理生理学教研室，贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室，贵州贵阳550025）

游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）是指非酯化的脂肪酸，作为机体的一种能量物质，FFAs异常增高可引起脂类代谢异常和糖类代谢紊乱［1］，在高血压和心力衰竭等心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的发病过程中起着重要的作用［2-3］。FFAs中的饱和脂肪酸棕榈酸（palmitate acid，PA）是人体内含量最多的游离脂肪酸，参与肥胖、胰岛素抵抗和高脂血症等多种疾病的发生发展［4-6］。

内皮功能障碍（endothelial dysfunction，ED）是CVD发生发展的病理生理学基础，其重要表现为一氧化氮（nitric oxide，NO）的生物利用度降低［7］，而内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的活性改变能影响NO的产量和利用度。血管内皮细胞eNOS活性调节的一个分子机制是蛋白翻译后修饰，而磷酸化调控是翻译后修饰中重要的方式之一，在eNOS的磷酸化位点中Ser633的磷酸化水平增高可使该酶活性增强［8］，从而发挥血管保护作用，属正性调节。已有研究表明，PA处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）后，eNOSSer1177磷酸化水平降低，eNOS活性降低，NO生成减少，导致内皮损伤［9-10］。也有研究者发现，用FFA中的油酸刺激HUVECs，可降低eNOSSer1177磷酸化水平和eNOS的活性，导致NO产生减少，最终导致ED［11］。但目前尚未见文献报道PA是否对eNOSSer633磷酸化水平产生影响。

蛋白质去磷酸化的过程由蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）催化完成。本课题组前期研究结果表明血管紧张素 II（angiotensin II，Ang II）可激活蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）使eNOS Ser1177磷酸化水平降低［12-14］，然而迄今尚不明确能使eNOSSer633位点发生去磷酸化的蛋白磷酸酶。本研究在观察PA引起HUVECs中eNOSSer633磷酸化水平降低的基础上，继续探索是哪种蛋白磷酸酶在PA下调eNOSSer633磷酸化中发挥作用，旨在进一步探讨PA损害eNOS功能的分子机制，为阐明FFAs引起ED的发生机制提供更多实验依据。

材料和方法

1 主要材料与仪器

人脐静脉内皮细胞由贵州医科大学曾柱教授惠赠。无酚红高糖DMEM培养液和高糖DMEM培养液（HyClone）；胎牛血清（Biological Industries）；棕榈酸和福司曲星（fostriecin，FST）购自 Sigma；鼠抗人eNOS抗体和鼠抗人eNOSSer633抗体（BD）；兔抗鼠蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit，PP2Ac）抗体（Abcam）；鼠抗人PPX（PP4）抗体、PP4c siRNA及转染试剂（Santa Cruz）；PP2Ac siRNA（中国上海吉玛公司）；转染试剂LipofectamineTM3000（Invitrogen）；鼠抗人β-tubulin抗体、HRP标记的羊抗鼠II抗及羊抗兔II抗（中国武汉普美克生物技术有限公司）；冈田酸（okadaic acid，OA）、NO荧光探针DAF-FM DA（中国碧云天公司）。凝胶成像系统（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 体外培养HUVECs 用含10%胎牛血清FBS的高糖DMEM培养液在37℃、5%CO2条件下接种、培养HUVECs，每2 d更换1次培养液。当细胞生长密度达80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化并传代。取8～15代细胞用于实验。

2.2 配制棕榈酸 用20 mol/L HEPES（pH 7.0）配制0.1 mol/L氢氧化钠，将PA溶于其中调节其浓度为60 mol/L，将PA与10%牛血清白蛋白以1∶9混合，配成终浓度为6 mol/L的PA贮存液，-20°C保存。

2.3 棕榈酸处理HUVECs 分别用终浓度为25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的PA处理HUVECs 36 h，确定PA作用最佳浓度；另用100 μmol/L的PA分别处理细胞12 h、24 h、36 h和48 h，确定PA作用的时间。实验至少重复3次，根据结果后续实验使用100μmol/L PA处理细胞36 h。

2.4 PP2A抑制剂预处理HUVECs 用DMSO配制20μmol/L FST和5μmol/L OA贮存液，-20℃保存。HUVECs用20 nmol/L FST预处理30 min，或5 nmol/L OA预处理30 min，再用100μmol/LPA处理36 h。实验至少重复3次。

2.5 细胞内NO含量检测 将2μL荧光探针稀释于1 mL无血清、无双抗、不含酚红的培养液中，HUVECs换用此培养液后置于37℃、5%CO2培养箱内孵育30 min，然后用无血清、无双抗、不含酚红的培养液洗3次。倒置荧光显微镜观察并拍照，采用ImageJ软件分析荧光强度。实验重复3批次。

2.6 转染siRNA 将HUVECs接种于6孔板中，密度达40%～50%转染siRNA时细胞。严格按照转染试剂盒操作说明书进行。在1.5 mL无菌Ep管中先后加入不含血清和双抗的培养液、80 pmol siRNA和8μL转染试剂，混匀后室温下静置25 min。弃去原有培养液，生理盐水洗3次，将融合好的转染液加入6孔板中，轻晃摇匀，于培养箱中孵育6 h后弃去转染液，换含10%胎牛血清的培养液继续培养。实验重复至少3次。

2.7 Western blot检测蛋白水平 收集细胞加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000×g离心25 min，取5μL上清液采用BCA法测定蛋白浓度，剩余上清液加入3×上样缓冲液煮沸变性。经10%SDSPAGE分离后将蛋白转至PVDF膜上，加入5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗膜3次后加入适当比例稀释的I抗，4°C孵育过夜，第2天加入HRP标记的IgG，室温孵育1 h，TBST洗膜3次后，用ECL显影后曝光。Bio-Rad凝胶成像系统采集条带图像并分析条带积分吸光度（A）值，结果以β-tubulin为内参照，以目的条带与内参照条带的积分吸光度值的比值表示。以上结果至少重复3次独立实验，每批重复检测3次。

3 统计学处理

用SPSS24.0软件进行分析，所有统计学数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐者两两比较采用SNK-q法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PA下调HUVECs内eNOSSer633磷酸化水平

分别使用终浓度为25μmol/L、50μmol/L、100 μmol/L和200μmol/L的PA处理HUVECs 36 h，结果表明，与对照（control）组相比，PA处理后HUVECs内eNOSSer633磷酸化水平均显著降低（P＜0.05）；组间eNOS总蛋白表达无显著差异，见图1A。使用终浓度为100μmol/L PA分别处理HUVECs 12 h、24 h、36 h和48 h，结果表明，与control组相比，24 h、36 h和48 h组eNOS Ser633磷酸化水平均显著降低（P＜0.05）；组间eNOS总蛋白表达无显著差异，见图1B。

2 PP2A家族抑制剂预处理上调eNOSSer633磷酸化水平

用PP2A家族抑制剂FST（20 nmol/L）或OA（5 nmol/L）预处理HUVECs 30 min，再用100 μmol/L PA处理细胞36 h，结果表明，与control组相比，PA组eNOSSer633磷酸化水平显著降低（P＜0.05），FST组与OA组eNOSSer633磷酸化水平无显著差异；与PA组相比，FST+PA组与OA+PA组eNOSSer633磷酸化水平均显著增高（P＜0.05）；组间eNOS总蛋白表达无显著差异，见图2。

3 PP2A家族抑制剂预处理抑制PA诱导的细胞内NO产量减少

使用DAF-FM DA荧光探针检测各组细胞内NO产量，结果表明，与control组相比，PA组HUVECs内荧光强度降低，NO产量显著减少（P＜0.05），20 nmol/L FST处理组和5 nmol/L OA处理组荧光强度无显著差异；与PA组相比，FST+PA组和OA+PA组HUVECs荧光强度均增强，NO产量显著增多（P＜0.05），见图3。

4 PP4对eNOSSer633磷酸化具有调控作用

在HUVECs中转染PP4c特异性siRNA（si-PP4c），结果表明，与si-Control相比，si-PP4c组PP4c蛋白表达显著降低（P＜0.05），eNOSSer633磷酸化水平显著增高（P＜0.05），si-Control+PA组eNOSSer633磷酸化水平显著降低（P＜0.05）；与si-PP4c组相比，si-PP4c+PA组eNOSSer633磷酸化水平显著降低（P＜0.05）；与si-Control+PA组比，si-PP4c+PA组PP4c蛋白表达显著降低（P＜0.05），eNOSSer633磷酸化水平显著增高（P＜0.05）；组间eNOS总蛋白表达无显著差异，见图4A。

Figure 1.The levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs treated with palmitic acid（PA）.A：the levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs treated with different concentrations of PA for 36 h；B：the levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs treated with 100μmol/L PA for different time.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.图1 棕榈酸处理HUVECs后eNOS蛋白表达和eNOSSer633磷酸化水平的变化

Figure 2.The levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs pretreated with PP2A family inhibitor.A：the levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs pretreated with or without 20 nmol/L FSTfor 30 min and then treated with 100μmol/L PA for 36 h；B：the levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs pretreated with or without 5 nmol/L OA for 30 min and then treated with 100μmol/L PA for 36 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PA group.图2 PP2A家族抑制剂预处理后HUVECs中eNOS蛋白表达和eNOSSer633磷酸化水平的变化

在HUVECs中转染PP2Ac特异性siRNA（si-PP2Ac），结果表明，与 si-Control相比，si-PP2Ac组PP2Ac蛋白表达显著降低（P＜0.05），eNOSSer633磷酸化水平无显著变化，si-Control+PA组eNOSSer633磷酸化水平显著降低（P＜0.05）；与si-PP2Ac组相比，si-PP2Ac+PA组eNOSSer633磷酸化水平显著降低（P＜0.05）；与 si-Control+PA 组比，si-PP2Ac+PA 组PP2Ac蛋白表达显著降低（P＜0.05），eNOSSer633磷酸化水平无显著差异；组间eNOS总蛋白表达无显著差异，见图4B。

Figure 3.NOcontent in the HUVECs pretreated with PP2A family inhibitor.A：fluorescence map of each group（scale bar=50μm）；B：relative content of NOin each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PA group.图3 PP2A家族抑制剂预处理后细胞中NO产量的变化

讨 论

血管内皮细胞产生的NO具有扩张血管、抗炎、抗氧化损伤、抗凝和抗动脉粥样硬化及抗细胞凋亡等生物学效应，在维持心血管稳态方面有重要作用［15-16］。内皮细胞中的NO主要由eNOS的催化合成，eNOS基因缺失、表达减少以及活性降低都能使NO水平降低，促进ED发生发展。研究已证实体内FFAs升高可通过氧化应激、胰岛素抵抗、炎症反应和eNOS/NO途径受损等导致内皮功能发生障碍［17-18］，降低FFAs可能对心血管疾病具有一定防治作用［19］。有研究报道［9-10］PA 处理 HUVECs后，eNOS Ser1177磷酸化水平降低，然而PA是否引起内皮细胞eNOSSer633磷酸化水平HUVECs内变化尚未见文献报道。本研究观察到PA处理HUVECs后呈浓度依赖地降低HUVECs内eNOSSer633磷酸化水平，100μmol/L PA处理HUVECs 36 h时eNOSSer633磷酸化水平降低至50%左右，进一步用100μmol/L PA处理细胞不同时间，24 h、36 h和48 h组eNOSSer633磷酸化水平均有降低，其中36 h组eNOSSer633磷酸化水平降低至约50%。本实验进一步用荧光探针检测细胞中NO产量，PA组NO产量明显降低，与文献［9-10］结果一致，即PA可以减少NO生成。但PA引起eNOSSer633磷酸化水平降低的分子机制尚不清楚。

血管内皮细胞中PP2A对eNOS的磷酸化修饰有重要调控作用，体内外研究已证明AngII可激活PP2A使eNOSSer1177去磷酸化，降低eNOS的活性，从而减少NO生成，导致ED［12-14］。PP2A能否使eNOS Ser633去磷酸化需要进一步研究。PP2A家族包括PP2A、蛋白磷酸酶4（protein phosphatase 4，PP4）和蛋白磷酸酶6（protein phosphatase 6，PP6），在多种病理生理过程中起着重要的作用，其中PP4与PP2A有65%的氨基酸同源［20］。本研究观察到PA处理HUVECs后eNOSSer633磷酸化水平降低，进一步使用PP2A家族抑制剂FST 20 nmol/L或OA 5 nmol/L预处理HUVECs后观察到eNOSSer633磷酸化水平增高。根据文献报道FST（20 nmol/L）对PP4的抑制作用与PP2A相似［21］，低剂量OA（5 nmol/L）对PP2A和PP4都有抑制作用［22］，因此推测PA可能通过激活PP4和（或）PP2A导致eNOSSer633磷酸化水平降低。由于PP2A家族成员的结构相似，对其功能研究使用抑制剂难以确定某个磷酸酶的作用，因此尚不确定究竟是PP2A还是PP4发挥作用。

Figure 4.The levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs transfected with PP4c siRNA or PP2Ac siRNA.A：the levels of PP4c，eNOSand eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs transfected with PP4c siRNA；B：the levels of PP2Ac，eNOS protein and eNOS Ser633 phosphorylation in the HUVECs transfected with PP2Ac siRNA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-Control group；△P＜0.05 vs si-PP4c group；#P＜0.05 vs si-PP2Ac group；★P＜0.05 vs si-Control+PA group.图4 敲减PP4c和PP2Ac后eNOS蛋白表达和eNOSSer633磷酸化水平的变化

PP4由催化亚基PP4c和4种调节亚基PP4R1、PP4R2、PP4R3及PP4R4构成，催化亚基和不同的调节亚基组合成多种不同的二聚体或三聚体PP4全酶，参与许多重要的细胞过程［23］。PP2A是一种异源三聚体蛋白复合物，由催化亚基PP2Ac和结构亚基A形成二聚体再与调节亚基B形成不同的异源三聚体［23］。本实验采用 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术，在HUVECs内转染PP4c亚基或PP2Ac亚基特异性siRNA，抑制PP4c或PP2Ac蛋白表达水平，从而降低PP4和PP2A活性，进一步明确是哪一种蛋白磷酸酶发挥作用。结果显示，敲减PP4c表达后，eNOSSer633磷酸化水平显著上调，而敲减PP2Ac表达后，eNOSSer633磷酸化水平无显著变化，提示PA有可能通过激活PP2A家族中PP4而不是PP2A降低eNOSSer633磷酸化水平。

综上所述，在HUVECs中，PA可能通过激活PP4而不是PP2A引起eNOSSer633水平降低，NO产量减少。本研究报道了PP4对eNOSSer633的磷酸化调控作用，但PP4调控eNOSSer633磷酸化的具体分子机制还有待进一步研究。