UPS-E3泛素连接酶ITCH与胰岛素抵抗的关系*

郭 豪， 马 玉， 常晓彤

（河北北方学院临床检验诊断学重点实验室，河北张家口075000）

糖尿病已成为严重的世界性公共卫生问题，预计至2045年全球糖尿病患者将超过6亿人［1］。胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要表型，是指各种原因导致胰岛素促进葡萄糖摄取和利用率下降，机体代偿性地分泌过多胰岛素，产生高胰岛素血症。胰岛素是一种蛋白类激素，促进糖原、脂质和蛋白质合成等多种生物代谢过程，其作用的发挥依赖于胰岛素信号正常转导；胰岛素重要靶器官如肝脏、脂肪、肌肉、胰腺和脑中胰岛素信号通路阻断将导致胰岛素抵抗。胰岛素信号是一种短暂的效应，信号分子在胰岛素的分泌和功能发挥中起着重要的作用。细胞中蛋白质水平的稳态取决于其合成和降解的速率，其中降解过程是通过2个紧密调控的系统来完成的，即溶酶体和蛋白酶体系统，靶向降解错误折叠或受损的蛋白质。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）是细胞内80%蛋白质降解的主要途径，其中底物泛素化过程的特异性取决于E3泛素连接酶。已有研究发现E3泛素连接酶ITCH在机体胰岛素抵抗中发挥关键作用［2］。本文以ITCH的结构和作用机制为基础，阐述其与胰岛素抵抗的相关性，为进一步研究ITCH的功能和胰岛素抵抗的机制提供理论基础。

1 UPS及泛素化

1.1 UPS UPS是真核细胞中选择性降解蛋白质的主要途径，在细胞周期、信号转导、转录调控、DNA损伤等多种生物学过程发挥着重要作用［3］。该系统与胰岛素信号通路相关，可参与胰岛素受体（insulin receptor，IR）的内化、胰岛素受体底物1/2（insulin receptor substrate 1/2，IRS1/2）表达量的调控和胰岛素的降解［4］。UPS也参与炎症反应，有报道称蛋白酶体抑制剂具有抗炎作用，UPS异常与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等多种疾病的发生和发展相关［5-6］。

1.2 泛素化 泛素（ubiquitin，Ub）是一种存在于所有真核细胞、高度保守且大量表达、含76个氨基酸残基的蛋白分子。泛素化是重要的翻译后修饰，靶蛋白泛素化首先通过E1泛素活化酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的多酶级联介导、多肽泛素的共价加成而标记，然后经26S蛋白酶体识别并降解，见图1B。泛素化的调控是由底物特异性的E3泛素连接酶介导［7］。机体通常含有少量E1s和E2s，而含有大量E3s，主要分为HECT、RING和U-box蛋白3种类型。HECT是位于蛋白质羧基端的一个结构域，它的关键特征是半胱氨酸残基在催化底物泛素化前与泛素羧基末端形成中间硫代酯键［8］。

2 ITCH及其作用底物

ITCH，又称atrophin 1相互作用蛋白4（atrophin 1-interacting protein 4，AIP4），是一种高度保守的HECT家族E3泛素连接酶，相对分子质量为113 000，是含有854个氨基酸残基的单体蛋白，其结构包括：1个N端C2结构域，介导募集的底物蛋白进入细胞膜内；4个WW结构域介导与靶蛋白特异性相互作用，可募集具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点或含PPXY结构域的底物蛋白；1个C端HECT结构域可将活化的泛素分子由E2泛素结合酶转移至靶蛋白；1个PRD结构域位于第195～246个氨基酸残基之间，参与分拣连接蛋白9（sorting nexin 9，SNX9）等底物蛋白的募集，见图1A。

Figure 1.The structure of ITCH（A）and its mechanism of participating in ubiquitin cascade（B）.In an ATP-requiring step，a thioester bond is formed between the carboxyl terminus of ubiquitin and an cysteine residue of ubiquitin activating enzyme（E1）；activated ubiquitin is then transferred to a specific cysteine residue of ubiquitin conjugating enzyme（E2）；the HECT domain of itch binds to the E2-ubiquitin complex and transfers the activated ubiquitin to a catalytic cysteine residue of its C-terminal region，and then catalyzes the ubiquitin transfer from the HECT domain to the lysine residues of the substrates；the ubiquitinated substrates are degraded by the 26Sproteasome.图1 ITCH的结构及其参与泛素化级联的作用机制

生理情况下，ITCH的WW结构域与含PPXY基序的底物特异结合，催化其泛素化并经蛋白酶体降解，参与底物介导的免疫调控、细胞周期等多种生物过程。ITCH催化蛋白质泛素化可分为两步：首先HECT结构域与E2-泛素复合物结合，并将活化的泛素转移到其羧基端催化半胱氨酸残基上，然后催化泛素从HECT结构域转移到底物的赖氨酸残基上［9］。已有研究显示，ITCH的作用靶点是多种信号通路的核心参与调控者。

2.1 Jun蛋白家族 c-Jun/JunB是一种活化蛋白1（activator protein 1，AP-1）转录因子的成分，现已证实，c-Jun和JunB均是ITCH的底物蛋白［10］。经脂多糖等刺激的巨噬细胞中，炎症相关基因如白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）的表达依赖于 JunB［11］。在ITCH表达缺失的T细胞中，JunB蛋白表达增加，增强与IL-4结合的活性，后者可通过信号转导及转录激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）通路参与抗炎M2型巨噬细胞的代谢及作用的发挥［12］。此外，JunB调节IL-4基因的转录，诱导Th2淋巴细胞介导的M2型巨噬细胞极化，产生IL-10等抗炎细胞因子，从而防止肥胖和胰岛素抵抗［13］。ITCH靶向结合c-Jun和JunB，催化其泛素化及降解，降低其在防止肥胖相关炎症和胰岛素抵抗中的作用。

2.2 硫氧还相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP） TXNIP最初被认为是一种硫氧还蛋白的抑制剂，现已被报道与胰岛素抵抗相关［14］。在动物模型中，TXNIP的高表达可诱导胰腺β细胞凋亡，降低骨骼肌和脂肪等外周组织的胰岛素敏感性，通过结合并降低葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）的表达来抑制葡萄糖的摄取［15-16］。机体内质网应激下，TXNIP参与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的激活，增加IL-1β的生成，进而参与炎症发生［17］。但是，在细菌感染的巨噬细胞中，沉默TXNIP基因可促进Toll样受体2介导的诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6等炎性因子的产生［18］。ITCH介导的TXNIP在体内外的多泛素化及降解［19］，可能靶向TXNIP-炎症通路，调控机体的炎症状态。

2.3 Notch Notch是一种保守的Ⅰ型跨膜受体，它的激活与炎症、胰岛素抵抗等呈正相关［20-21］。实验表明，肝脏Notch1的表达缺失，诱导糖异生关键酶葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）表达增加，促进葡萄糖产生［22］。另外，Notch激活肝脏中营养敏感的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）通路，导致脂肪和甘油三酯生成增多［23］。ITCH通过WW结构域与Notch胞内结构域的N端结合，HECT结构域促进Notch的泛素化［24］，从而调控其生物学功能。

2.4 p53蛋白家族 p53是一种转录因子，调控细胞增殖与凋亡周期，p63和p73是其同源性转录因子［25］。越来越多的证据表明，p53家族成员在调节葡萄糖稳态方面起着重要作用，然而这些作用却不尽相同［26-27］。TAp63（p63亚型）缺乏的小鼠表现出葡萄糖不耐受、肥胖和胰岛素抵抗，而TAp73缺乏的小鼠在高脂饮食喂养下能防止葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗［28-29］。生理情况下，ITCH催化p63和p73泛素化及降解，使其保持相对较低水平［30］，调控p53蛋白家族成员对葡萄糖稳态的影响。

3 ITCH与胰岛素抵抗

有学者提出关于胰岛素抵抗发生的2种假说，即炎症假说和信号转导假说［31］。E3泛素连接酶在胰岛素抵抗和糖尿病过程中起着关键作用，其机制有两种：一是E3泛素连接酶通过UPS直接降解IR、IRS和其它关键胰岛素信号分子；二是通过调节参与胰岛素信号分子调节的促炎症介质间接调控胰岛素信号，例如 TNF-α、IL-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白 1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、低氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）等［2］。胰岛素抵抗的发病机制复杂，是多因素相互作用及影响的结果，包括靶器官细胞胰岛素敏感性降低、胞内信号分子转导受阻、机体代谢紊乱等。

3.1 ITCH靶向炎症 炎症联系肥胖与胰岛素抵抗。脂肪组织巨噬细胞和T细胞的活化与肥胖所致的促炎症状态有关。M1型巨噬细胞由干扰素γ诱导，分泌促炎性细胞因子，在肥胖脂肪组织中占主导地位，M2型巨噬细胞主要由Th2淋巴细胞分泌的IL-4和IL-13诱导，产生抗炎细胞因子IL-10。已有研究显示，ITCH-/-小鼠中脂肪组织浸润的巨噬细胞呈慢性M2型极化，巨噬细胞半乳糖型凝集素2（macrophage galactose-type lectin 2，Mgl2）、精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、几丁质酶3样蛋白1（chitinase 3-like protein 1，CHI3L1）等M2型巨噬细胞标志物的表达显著增加，防止小鼠体重增加及肥胖刺激下的代谢紊乱［13］。体外研究应用siRNA沉默巨噬细胞中ITCH的表达，导致促炎因子IL-1β减少，抗炎因子IL-10表达增加。也有研究表明，ITCH缺乏对肥胖的影响是由高脂饮食引起的炎症所介导的，当高脂饮食被阻断时，ITCH基因敲除小鼠在生理过程中体重的变化趋势与野生型小鼠相同，提示在无高脂饮食或炎症刺激的情况下，ITCH缺乏不影响小鼠的代谢表型［13］。

炎症通路通过多种途径与胰岛素抵抗相连，主要有IκB激酶β（inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路。ITCH的表达水平与NF-κB转录因子的表达水平相关。研究表明，在骨折修复的早期阶段，NF-κB结合目的基因启动子中的相应位点来上调ITCH等含有WW结构域的E3泛素连接酶的表达水平，抑制成骨细胞的分化［32］。含核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2，NOD2）是一种炎症性肠病——克罗恩病的易感蛋白，参与协调细胞刺激后的细胞因子应答，其中ITCH直接通过K-63连接多聚泛素化NOD2结合蛋白RIP2，调控NOD2依赖的信号转导通路，即NF-κB信号通路和Ras-丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，参与NOD2介导的炎症性疾病的发生［33］。具体地，ITCH增强NOD2/RIP2通路诱导炎症通路中JNK和p38的活性，但抑制NF-κB的激活。泛素编辑酶A20是炎症和细胞因子介导的NF-κB激活的关键负调节因子，ITCH作为A20泛素编辑复合物的亚基之一，参与A20底物的识别和灭活，负向调控炎症信号通路［34］。目前已知，JNK与胰岛素抵抗的发展相关，机制可能是激活ITCH进一步参与胰岛素抵抗。因此，ITCH可通过靶向炎症通路细胞和分子，调控机体代谢表型和胰岛素抵抗的发生。

3.2 ITCH调控机体代谢物质的水平 胰岛素抵抗与许多代谢紊乱相关。正常情况下，胰岛素通过增加葡萄糖消耗和脂质合成来促进机体合成代谢，但机体发生胰岛素抵抗便不能抑制肝脏葡萄糖的产生，自相矛盾的是，肝脏脂质合成增加，导致高血糖和高甘油三酯血症。

不同胰岛素敏感性人群的ITCH表达分析显示，ITCH与脂肪组织炎症细胞表型相关，饮食诱导小鼠肥胖的前提下，ITCH基因缺失的脂肪组织细胞体积较小、密度偏高，表现出抗炎模式［13］。经高脂饮食喂养数周后，ITCH-/-小鼠的空腹血糖水平明显降低，糖耐量得到改善，在空腹和普通饮食状态下血清胰岛素水平下降，胰岛素抵抗指数的稳态模型评估值明显降低［13］。已知IL-13是介导M2型巨噬细胞激活的Th2细胞因子，在ITCH-/-小鼠的肝脏中，抗炎细胞因子IL-13水平升高，激活下游STAT3通路，抑制葡萄糖生成基因的转录，从而抑制肝脏葡萄糖的产生［35］。关于脂质代谢，与野生型小鼠相比，ITCH-/-小鼠的肝脏甘油三酯水平明显降低，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）表达显著上调，后者在组织巨噬细胞中促进M2型极化，增加组织的氧化代谢和能量消耗，改善胰岛素抵抗［13］。研究发现，ITCH泛素化并降解脱乙酰酶sirtuin-6（SIRT6），减少脂肪酸氧化并促进肝脏脂质浸润；另外，ITCH缺失阻止细胞核中固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）的清除，导致循环胆固醇水平降低［36］。将动脉粥样硬化模型小鼠体内ITCH和载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除后，M2型巨噬细胞增多，循环斑块形成减少，同时出现肝脂肪变性减少、线粒体氧化能力增强，脂肪酸氧化增加等脂质代谢改善状态［36］。总之，ITCH表达缺失背景下，机体甘油三酯、胆固醇等脂质含量减少，血清葡萄糖及胰岛素水平降低，胰岛素抵抗状态有所减轻。因此，ITCH的表达调控可以作为治疗以高脂血症和高胆固醇血症为主要症状的胰岛素抵抗的一个靶点。3.3 ITCH靶向胰岛素及其信号通路 胰岛素生物学效应的发挥依赖于细胞中各级信号分子的逐级转导，其中任何信号分子受抑制或降解，通路被阻断，即导致胰岛素抵抗的发生。既往研究报道，人肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗状态下，ITCH蛋白表达上调，可能通过靶向降解胰岛素信号通路中关键信号分子，抑制胰岛素信号转导［37］。

Gli样转录因子3（Gli-similar 3，Glis3）是Krüppel样锌指转录因子的一个亚家族，参与调控胰腺β细胞生成和成熟、胰岛素基因表达等重要生物过程［38］。ITCH作为Glis3介导的转录活性的关键负调节因子，可导致其多泛素化并通过蛋白酶体降解而降低Glis3的稳定性，显著抑制Glis3介导的胰岛素基因的转录激活，影响胰岛素生物学效应［39］。研究表明，ITCH-/-小鼠的肌肉组织中，胰岛素受体Tyr972和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）Ser473的磷酸化程度明显增强，从而促进胰岛素信号转导［13］。叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1，FOXO1）是胰岛素信号通路的重要下游因子，ITCH基因缺失引起底物JunB表达上调以促进miR-182的表达，后者结合FOXO1 3′端非翻译区，降低了FOXO1的表达［40］，抑制其对糖异生关键酶的调控，肝脏糖异生作用减低，血糖下降。人表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor，HER3）的表达与胰腺癌、乳腺癌等肿瘤的进展相关。抗HER3抗体9F7-F11可诱导ITCH靶向结合HER3，导致HER3泛素化并被蛋白酶体降解。相应地，siRNA介导ITCH基因敲减，可抑制9F7-F11诱导的HER3泛素化降解，恢复HER3磷酸化，促进AKT和细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）磷酸化［41］，进而促进胰岛素关键信号通路——PI3K/AKT信号通路的转导。因此，ITCH介导的胰岛素信号分子的降解或信号通路的阻断可能是胰岛素抵抗的分子机制之一。

4 小结

综上所述，E3泛素连接酶ITCH可直接调控胰岛素基因转录及其信号通路分子水平，或通过影响炎症细胞表型和炎症因子水平间接调控机体甘油三酯、胆固醇等代谢物质水平，进而参与胰岛素抵抗的发生。因此，控制机体ITCH蛋白的表达，可能是预防或治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病的新方法。但也有少数报道，如前所述，ITCH作用于底物TXNIP可减轻机体炎症状态。目前关于ITCH参与胰岛素抵抗的具体分子机制还未明确，有待未来深入研究，为胰岛素抵抗相关疾病提供新的理论基础和实验依据。