中性粒细胞胞外诱捕网在新生大鼠急性肺损伤中的作用*

徐苏晴， 常 明， 宓兰兰， 蔡佳玉， 薛正阳， 卢红艳

（江苏大学附属医院儿科，江苏镇江212001）

中性粒细胞在机体对抗病原的先天免疫中起着关键作用。Brinkman等［1］于2004年发现，中性粒细胞在细胞外产生一种由组蛋白、DNA和蛋白酶组成的网状结构，即中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs是以DNA为骨架、其间镶嵌多种蛋白成分的DNA-蛋白质复合物，蛋白成分主要是瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3，CitH3），其次是髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、粒状酶和多肽，其具有促炎及细胞毒作用［2］。生物体或病原体产生的各种生物分子均可诱导中性粒细胞活化，产生 NETs［3］。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肺损伤（acute lung injury，ALI）成年小鼠模型中，研究者发现小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）及血浆中NETs水平均增高，使用NETs抑制剂脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）后，小鼠ALI症状得到缓解，提示NETs的产生可造成肺组织损伤［4］。新生儿急性肺损伤为新生儿危重症，其严重形式表现为急性呼吸窘迫综合征，是由多种原因引起的肺部弥漫性损伤。NETs及其组成成分是否加重新生大鼠ALI症状，目前并不清楚。本文拟通过分析新生SD大鼠ALI模型中BALF及肺组织中NETs的含量及结构，探讨NETs在新生大鼠急性ALI中的作用。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物 30只7日龄的新生SD大鼠购自江苏大学实验动物中心，许可证号为SYXK（苏）2018-0053。

1.2 实验材料 LPS和小牛胸腺DNA购自Sigma；Sytox Green购自Invitrogen；兔来源抗CitH3抗体购自Abcam；山羊来源抗MPO抗体购自R&D；Alexa Fluor 488驴抗兔荧光抗体、Alexa Fluor 594驴抗山羊荧光抗体和DAPI染料购自上海翊圣生物科技有限公司；SDS-PAGE凝胶制备盒试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；抗GAPDH抗体购自苏州睿瀛生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG和兔抗羊IgG购自Immunoway；大鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 实验动物分组及处理 出生7 d的SD新生大鼠30只，按照随机数字表法分成生理盐水对照组（control组）、ALI组及ALI+Dnase组，每组10只。ALI组用LPS以20 mg/kg的剂量腹腔注射建立新生大鼠ALI模型，ALI+Dnase组则在注射LPS后即腹腔注射Dnase（5 mg/kg）。给药6 h后，使用水合氯醛麻醉新生鼠，收集BALF，使用左肺组织制备组织匀浆液，右肺组织固定于4%多聚甲醛中。

2.2 检测BALF中游离DNA（cell-free DNA，cf-DNA） 使用绿色荧光染料Sytox Green对新生大鼠BALF中的cf-DNA进行检测。Sytox Green∶PBS=1∶5 000进行稀释，配制1 000μg/L、500μg/L、250μg/L、125μg/L、62.5μg/L、10μg/L和0μg/L的小牛胸腺DNA做标准品，将BALF标本和不同浓度浓度梯度的标准品以每孔100μL的量加入相应孔中。避光条件下向每孔中加入100μL的稀释后Sytox Green，轻轻震荡10 s使其与染料混匀，即刻用荧光酶标仪在485 nm波长下测量各个样本和标准品的荧光强度。

2.3 HE染色观察肺组织形态结构 将取材完毕后的右肺组织置入4%多聚甲醛溶液中固定，48 h后进行脱水浸蜡、石蜡包埋并制作厚4.5μm切片，光镜下观察HE染色肺组织形态及结构改变。光镜下观察肺组织病理学变化并进行评分。评分标准如下［5］：对肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集、肺泡壁增厚和（或）透明膜形成4项指标，分别依病变轻重评0～4分（0：无病变或非常轻微；1：轻度病变；2：中度病变；3：重度病变；4：极重度病变）。各项评定分数相加为各组肺组织损伤总评分。

2.4 免疫荧光法检测肺组织中CitH3及MPO的水平 留取的肺组织制备成石蜡切片，脱蜡后用抗原修复液进行修复，PBS洗3次，3%BSA封闭1 h，抗CitH3抗体（1∶200）4℃孵育过夜，PBS洗3次，加入Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594抗体室温孵育 1 h，PBS洗3次，DAPI染核10 min，PBS清洗后防淬灭封片剂封片，免疫荧光显微镜观察。

2.5 Western blot检测肺组织中CitH3及MPO的水平 将不同组中新生鼠肺组织剪碎后按照每20 mg加入200μL RIPA提取蛋白。按每泳道10μL上样至12%梯度胶进行电泳，转膜2 h将蛋白转移至PVDF膜上，封闭1 h，I抗按照1∶2 000比例4℃孵育过夜。TBST洗膜后II抗孵育1 h，用凝胶分析成像系统扫描并进行半定量分析，目的蛋白相对表达量=目的蛋白吸光度/内参照吸光度。

2.6 ELISA检测肺组织匀浆液中IL-6和TNF-α的含量 将肺组织按照1 g组织样品加入9 mL预冷PBS的方法，经剪碎、研磨、离心等步骤制备组织匀浆液。加样前使用BCA方法测定蛋白浓度。按照试剂盒说明书步骤经加样、孵育、洗涤、显色、终止等步骤后，立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度。

3 统计学处理

实验数据以均数±标准误（mean±SEM）表示，使用GraphPad Prism 7.0软件通过单因素方差分析进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 BALF中cf-DNA含量

与对照组相比，ALI组与ALI+Dnase组BALF中cf-DNA均升高（P＜0.05）；ALI+Dnase组BALF中cf-DNA较ALI组降低（P＜0.05），见图1。这说明与对照组相比，ALI组中NETs水平增高，使用Dnase后NETs水平降低。

Figure 1.The levels of cf-DNA in BALFof different groups measured by fluorescence microplate.Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ALIgroup.图1 BALF中cf-DNA含量的变化

2 肺组织形态结构

HE染色结果可见，对照组大鼠肺泡结构和气道黏膜上皮完整，支气管和血管周围未见明显炎症细胞浸润；ALI组新生大鼠肺组织有肺毛细血管通透性增高，肺部水肿，气管内和血管周围可见炎症细胞广泛浸润，以嗜中性细胞增多为主；ALI+Dnase组新生大鼠的肺组织病变明显减轻，支气管和血管周围炎症细胞浸润明显减少，气道黏膜充血水肿减轻，见图2。肺损伤评分显示，与对照组相比，ALI组肺损伤严重（P＜0.05），ALI+Dnase组较ALI组肺部损伤情况缓解（P＜0.05），见图3。

Figure 2.HE staining of lung tissues in the rats of each group（×200）.图2 肺组织HE染色结果

Figure 3.The results of lung histopathological injury scoring.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ALIgroup.图3 肺组织病理学损伤评分结果

3 各组大鼠肺组织中CitH3及MPO免疫荧光染色

荧光显微镜下，ALI组与ALI+Dnase组大鼠肺组织中均可见绿色荧光免疫反应阳性产物CitH3及红色荧光免疫反应阳性产物MPO，且其产生水平均高于对照组（P＜0.05）；ALI+Dnase组的肺组织中CitH3及MPO较ALI组降低（P＜0.05），见图4。这说明ALI新生大鼠肺组织中NETs水平增高，而Dnase可降低NETs水平。

4 各组大鼠肺组织中CitH3及MPO蛋白表达水平

Western blot结果显示，与对照组相比，ALI组与ALI+Dnase组的肺组织中CitH3及MPO均升高（P＜0.05）；ALI+Dnase组的肺组织中CitH3及MPO较ALI组降低（P＜0.05），见图5。这说明Dnase可降低ALI新生大鼠肺组织中的NETs水平。

5 肺组织匀浆中IL-6和TNF-α含量的变化

与对照组相比，ALI组与ALI+Dnase组的肺组织匀浆中IL-6及TNF-α的含量均升高（P＜0.05）；ALI+Dnase组的肺组织匀浆中IL-6及TNF-α的含量较ALI组降低（P＜0.05），见图6。

讨 论

ALI是肺部急性弥漫性炎症，在新生儿重症监护室中较常见，多种因素均可导致ALI发生。在ALI过程中，肺泡毛细血管屏障功能受损，渗出的富含蛋白质的液体进入肺泡，形成水肿和透明膜，导致急性呼吸衰竭。ALI发病过程较为复杂，其发病机制至今未得到完全阐明。目前认为新生儿ALI发生、发展与中性粒细胞有密切联系。

Figure 4.Immunofluorescence staining for CitH3（green）and MPO（red）in the lung tissues（×200）.The nucleus was stained by DAPI（blue）.Merged images showed NETs（orange）.The bar chart showed the area of NETs.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ALIgroup.图4 肺组织中CitH3及MPO免疫荧光染色观察

Figure 6.The levels of IL-6 and TNF-α in the lung tissue homogenate of different groups measured by ELISA.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ALIgroup.图6 肺组织匀浆中IL-6和TNF-α含量的变化

NETs是由中性粒细胞释放的以DNA为骨架、多种蛋白质镶嵌其中的复合物质，其中主要致病物质为CitH3、MPO等多种蛋白质成分。BALF中的DNA水平可反映NETs的生成水平。有研究者在LPS诱导的成年小鼠ALI模型中，发现小鼠BALF中DNA含量明显增加，而DNase可在胞外降解NETs中的DNA，在使用DNase后，BALF中DNA含量明显降低，疾病症状减轻，提示在成年ALI小鼠模型中，BALF中较高水平的NETs对肺组织有损伤作用，且NETs水平可反映疾病严重程度［4］。在ALI患者BALF中，与对照组相比，其NETs水平也呈增高趋势［6］。在本研究中，与对照组相比，ALI组BALF中NETs水平升高，且肺组织中炎症浸润程度明显，提示NETs对肺组织有损伤作用；而在注射DNase后，BALF中NETs水平降低，且肺组织中炎症浸润程度较ALI组有所好转，提示在降低了NETs后，肺组织炎症浸润程度有所减轻。

CitH3为NETs的组成成分，CitH3的生成水平可反映NETs产生水平。中性粒细胞组蛋白的翻译后修饰在调节中性粒细胞死亡中起着关键作用［7］。组蛋白瓜氨酸化可促进不依赖于NADPH氧化酶的NETs形成［8］。组蛋白在体内外均可对上皮细胞产生细胞毒性作用，加重ALI症状［9］。MPO为NETs的重要组成部分，且其对上皮细胞与内皮细胞均有毒性作用［10］，检测其含量也可反映NETs生成水平。在成年ALI小鼠模型中，研究者利用免疫荧光技术，发现在肺组织中可见CitH3及MPO水平较对照组明显增加。在本研究中，与对照组相比，ALI组肺组织中的NETs水平升高，且肺组织炎症浸润情况严重，这可能是NETs中的组蛋白、MPO等成分对肺组织的损伤造成的。当注射DNase后新生ALI小鼠肺组织中NETs水平降低，即组蛋白、MPO等物质生成减少，从而减轻肺部损伤。DNase导致了CitH3和MPO水平的下降，但只是部分地，而不是完全地减少了NETs的产生，这是因为DNase处理NETs时可能促进巨噬细胞的清除作用，从而降低了CitH3和MPO水平［11］。

IL-6是引起ALI炎症级联反应的关键炎症因子，主要由T细胞、单核细胞-巨噬细胞和内皮细胞分泌［12］。此外，它还激活中性粒细胞，介导肝脏大量急性期蛋白的分泌，最终促进急性炎症反应。在创伤、感染发生时，巨噬细胞被激活，产生和释放大量TNF-α。TNF-α会损伤血管内皮，摧毁其屏障功能，并导致毛细血管通透性增加，大量液体渗出，形成肺水肿，因此导致 ALI［13］。与此同时，在整个 ALI疾病过程中，TNF-α可以减少机体产生的抗氧化物质，导致氧自由基的清除减少，从而加重组织损伤，并导致疾病恶化［14］。有研究表明，在新生儿ALI过程中，TNF-α和IL-6与ALI严重程度及预后密切相关，TNF-α和IL-6是反映肺损伤的重要指标。对TNF-α和IL-6水平进行动态监测，不仅对ALI早期诊断有意义，也对判断肺损伤严重程度及评价预后具有一定价值［15］。本研究中，ALI组肺组织匀浆中TNF-α和IL-6明显高于对照组，ALI+Dnase组中肺组织中的TNF-α和IL-6水平较ALI组明显降低，说明在使用NETs抑制剂Dnase后，新生大鼠肺组织炎性细胞浸润明显减少，肺组织病变明显减轻。

综上所述，在新生大鼠ALI模型中，NETs水平为反映肺组织损伤的重要指标，NETs抑制剂Dnase可有效减轻肺组织损伤，其作用机制为抑制NETs的组成成分CitH3、MPO等蛋白质对组织的损伤。本研究为新生儿ALI的治疗提供了新思路。