PM 2.5通过p38 MAPK信号通路影响血管平滑肌细胞增殖和迁移*

李昕倡， 吴玉莲， 吴 彤， 李 明， 叶 东， 罗雨渊， 李 岩△

（1广州中医药大学基础医学院，2广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州510006）

随着我国大气污染形势的日益严峻，大气污染对人类健康的危害性逐渐被研究者所认识。除严重影响呼吸系统外，大气污染与心血管系统疾病的发生也密切相关。多个流行病学研究显示，大气污染物浓度的升高可导致心血管疾病的发病率增高，住院和死亡人数明显增加［1-2］，表明大气污染与心血管疾病的发生密切相关［2-3］。细颗粒物（fine particulate matter，PM2.5）是大气污染物中致病的主要成分，PM2.5与冠心病和动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的相关性已经得到流行病学的证实，并被确认是新的AS致病危险因子。对于PM2.5致AS的作用机制，以往认为其主要是通过全身性炎症反应促进AS的发生，然而随着研究证实PM2.5能跨过肺气-血屏障进入血液循环［4］，其直接接触并损伤血管已成为PM2.5致病机制的研究重点。目前对于PM2.5致AS的研究主要集中在其对血管内皮细胞的影响上，如损伤血管内皮细胞和引起炎症反应等［5-6］，但PM2.5对人血管平滑肌细胞（human vascular smooth muscle cells，HVSMCs）的影响尚不完全清楚。致病因子活化HVSMCs，影响细胞的增殖和迁移能力是AS发生发展中的关键性环节［7］，因此本实验用PM2.5直接染毒HVSMCs，观察PM2.5对HVSMCs增殖和迁移的影响，并从p38 MAPK途径探索其作用机制，揭示PM2.5的血管毒性作用和机制。

材料和方法

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器 MCO-175 CO2培养箱（SANYO）；H1850R高速冷冻离心机（长沙湘仪）；680型酶标仪、电泳仪、电转仪和凝胶成像仪（Bio-Rad）；MS800显微镜（Olympus）。

1.2 主要试剂 PM2.5（编号SRM 1649b，Sigma-Aldrich）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）；抗MAPK抗体、抗phospho-MAPK-T180/Y182抗体、抗GAPDH抗体和HRP标记的II抗（ABclonal）；RIPA细胞裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物公司）；SB203580（批号129-56-6，Target Mol）。

2 实验方法

2.1 细胞株 HVSMCs购自深圳华拓市生物科技有限公司，用含10%FBS的DMEM完全培养基于5%CO2、37℃培养箱培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

2.2 CCK-8法观察PM2.5对HVSMCs活力的影响 取100μL（5×103个细胞）细胞悬液接种于96孔板内，分为对照组（加入PBS）和不同浓度PM2.5染毒组（终浓度分别为6.25，12.5和25 mg/L），培养24 h后根据分组进行染毒，每组6个复孔，另设空白组。继续培养24 h后根据试剂盒说明书每孔加入CCK-8溶液100μL，孵育4 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度（A），计算细胞相对活力。细胞相对活力（%）=（染毒组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%。

2.3 EdU法观察PM2.5对HVSMCs增殖的影响取HVSMCs悬液1 mL（1×105个细胞）接种于24孔板内预置的载玻片，培养24 h使细胞贴壁，分组同步骤2.2，按照分组进行染毒。染毒24 h后根据试剂盒说明书更换为含50μmol/L EdU的培养基继续孵育3 h，然后按步骤依次进行固定和染色，并用Hoechst 33342标记细胞，在共聚焦显微镜下进行采样观察。

2.4 划痕实验观察PM2.5对HVSMCs迁移的影响 取HVSMCs细胞悬液1 mL（5×105个细胞）接种于6孔板中，培养24 h后用100μL枪头垂直在培养板中划线，PBS清洗脱落的细胞，实验分组和处理同上，按分组分别加入PBS和PM2.5进行染毒，分别于0 h和24 h对细胞进行观察并拍照，测量划痕面积并计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

2.5 Transwell法观察PM2.5对HVSMCs迁移的影响 取200μL无血清细胞悬液（1×104个细胞）加入Transwell小室上室，实验分组和处理同上，按照分组加入PBS和PM2.5染毒；下室加入含15%FBS的DMEM培养基500μL，置于37℃培养箱培养24 h，取出上室用PBS清洗3次，多聚甲醛固定20 min，风干后用0.1%结晶紫染色30 min，在显微镜下随机选取5个视野拍照计数穿膜细胞数，用实验组与对照组穿膜细胞数比值代表细胞迁移能力的变化。

2.6 Western blot法检测p38 MAPK的磷酸化水平取HVSMCs悬液1 mL（5×105个细胞）接种于6孔板内，培养24 h后用终浓度为12.5 mg/L的PM2.5对细胞进行染毒，另设对照组。分别在染毒后不同时点（20、40、60和120 min）用RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取15μg蛋白进行SDS-PAGE，常规转膜、BSA封闭、加入I抗（1∶1 000）4℃孵育过夜后用TBST洗涤3次，再加入II抗（1∶5 000）孵育2 h，最后加入ECL发光液曝光、拍照，使用ImageJ软件对结果进行灰度值分析，计算磷酸化蛋白与总蛋白的比值。

2.7 p38 MAPK在PM2.5致HVSMCs增殖和迁移中的作用 实验分为PM2.5组和SB203580+PM2.5组，其中PM2.5组仅给予12.5 mg/L的PM2.5进行染毒，SB203580+PM2.5组则先给予10μmol/L的SB203580干预2 h后，再给予相应浓度的PM2.5进行染毒，在PM2.5染毒后用上述方法进行细胞增殖和迁移能力的检测。

3 统计学处理

以GraphPad Prism 7软件进行数据分析，实验结果用均数±标准差（mean±SD）表示，多样本组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组样本间检测则采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PM 2.5对HVSMCs增殖的影响

CCK-8检测结果显示，在6.25～25 mg/L浓度范围内PM2.5染毒使HVSMCs的活力明显增加，与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），其中在浓度为12.5 mg/L时作用效果最强，见图1。实验进一步采用EdU标记法来检测细胞的增殖情况，也得到了类似的结果，可见视野内绿染细胞数明显增多，见图2。上述两个实验证实PM2.5可促进HVSMCs的增殖。

Figure 1.The viability of HVSMCs exposed to PM2.5 for 24 h was measured by CCK-8 assay.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group.图1 CCK-8法检测不同浓度PM2.5对HVSMCs活力的影响

Figure 2.The proliferation of HVSMCs exposed to PM2.5 for 24 h was detected by EdU staining.The scale bar=100μm.图2 Ed U染色法检测不同浓度PM2.5对HVSMCs增殖的影响

2 PM 2.5对HVSMCs迁移能力的影响

采用划痕实验和Transwell实验分别检测了PM2.5染毒对HVSMCs迁移能力的影响。划痕实验结果显示，PM2.5染毒组划痕面积在24 h时明显较对照组减小，计算各组划痕愈合率发现PM2.5染毒组细胞划痕愈合率较对照组明显增加（P＜0.05），见图3A。Transwell实验结果也显示，PM2.5染毒后穿膜HVSMCs细胞数显著增加，说明PM2.5染毒后细胞迁移能力增强，与划痕实验结果相一致，见图3B。同时划痕实验和Transwell实验结果也显示12.5 mg/L浓度组对细胞迁移能力影响最强，因此选择12.5 mg/L为最佳浓度进行后续实验。

3 PM 2.5对p38 MAPK磷酸化的影响

我们根据上述结果以12.5 mg/L的PM2.5染毒HVSMCs，用Western blot法检测p38 MAPK的磷酸化水平，结果显示PM2.5染毒后HVSMCs胞内磷酸化p38 MAPK含量显著增多，与对照组比较差异有统计学显著性（P＜0.01），说明PM2.5染毒可活化p38 MAPK信号分子；研究结果还显示p38 MAPK的活化在染毒后20 min时最强，这其他研究者的结果相类似，一般认为细胞受外界刺激后p38 MAPK激活较快且激活高峰往往出现在受刺激的早期，进而引起细胞增殖和迁移等行为学改变［8］。本部分结果提示PM2.5活化HVSMCs可能与上调p38 MAPK蛋白磷酸化水平有关，见图4。

Figure 3.The migration ability of HVSMCs induced by PM2.5 was detected by scratch assay and Transwell method.A：scratch wound healingassay（×40）；B：Transwell assay（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图3 PM 2.5对HVSMCs迁移能力的影响

Figure 4.The phosphorylation level of p38 MAPK in HVSMCs exposed to PM2.5 with or without SB203580 treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs20 min group.图4 PM2.5对p38 MAPK磷酸化的影响

4 p38 MAPK在PM 2.5激活HVSMCs中的作用

SB203580是p38 MAPK分子的特异性阻断剂，我们用SB203580预处理HVSMCs，结果显示SB203580预处理可以显著降低PM2.5引起p38 MAPK磷酸化，见图4。因此我们用SB203580为工具来处理细胞，观察阻断p38 MAPK后HVSMCs在PM2.5刺激下的增殖和迁移变化，以此来明确p38 MAPK信号分子在PM2.5影响HVSMCs中的作用。CCK-8实验和EdU染色实验结果显示，与PM2.5单独作用组比较，SB203580+PM2.5组细胞的增殖能力显著降低，说明阻断p38 MAPK信号途径降低了PM2.5促进HVSMCs增殖的效果，见图5A、B。划痕实验和Transwell实验结果则显示，阻断p38 MAPK信号后PM2.5对HVSMCs迁移能力的影响明显减小，无论是划痕愈合率还是穿膜细胞的比例，SB203580+PM2.5组均显著低于PM2.5组（P＜0.05，P＜0.01），见图5C、D。上述结果证实p38 MAPK信号途径参与介导PM2.5促HVSMCs增殖和迁移过程。

讨 论

Figure 5.The proliferation and migration ability of HVSMCs exposed to PM2.5 with or without SB203580 pre-treatment.A：the cell viability；B：EdU staining（scale bar=100μm）；C：scratch wound closure rate（×40）；D：the cell invasive rate detected by Transwell assay（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PM2.5 group.图5 SB203580预处理对PM2.5促HVSMCs增殖和迁移的影响

2013年Adar等［9］通过对5 660人长达2年半的观察，发现PM2.5可加重动脉中层硬化（AS的前期病变），而降低PM2.5浓度能减缓疾病的进程，明确指出PM2.5可独立致AS发生，其它多个研究也证实了该结论［1-3］。PM2.5已经被公认为是AS等心血管疾病的重要致病因子，对其致病机理的研究是目前的重点［1］。

HVSMCs被致病因子激活，细胞增殖和迁移能力增强是AS发生发展中的关键性步骤和重要病理改变，然而PM2.5对HVSMCs的影响并不完全清楚［7，10］。本实验在体外培养 HVSMCs，用 PM2.5直接染毒来观察细胞增殖和迁移能力的变化。CCK-8法结果显示在一定浓度范围内PM2.5染毒可明显促进血管平滑肌细胞的活力，不同浓度PM2.5染毒组的细胞活力均显著高于对照组；实验还采用EdU染色法对细胞增殖情况进行了观察，也得到了同样的结果，证实PM2.5可促进HVSMCs的增殖。本研究还通过划痕实验发现PM2.5染毒也提高了血管平滑肌细胞的迁移能力，并用Transwell实验的进一步证实了该结论。实验还发现PM2.5影响HVSMC并无浓度依赖性，25 mg/L组细胞增殖和迁移能力低于12.5 mg/L组，这可能与随着PM2.5浓度增高其非特异性细胞毒活性增强有关，以往也有研究发现在低浓度时PM2.5可促进气管平滑肌细胞的迁移，而高浓度时则引起细胞死亡［11］，与本实验结果相类似，但是对于其具体原因尚需进一步研究。因此，本实验结果证实了在一定浓度范围PM2.5染毒能激活血管平滑肌细胞，促进细胞的增殖和迁移能力，证实PM2.5可能通过影响HVSMCs来促进AS的发生。

p38 MAPK是丝裂原激活蛋白激酶超家族的重要成员，参与多种细胞的胞内信号传递，贯穿细胞的生长、分化和死亡过程，特别在肌细胞分化中起着至关重要的作用［12］。研究显示p38 MAPK被激活后进入HVSMCs细胞核，催化丝/苏氨酸磷酸化引起下游基因转录，从而促进细胞的增殖和迁移［13］。多个研究证实激活p38 MAPK信号途径是AS致病因子活化HVSMCs的主要方式之一，抑制p38 MAPK可阻止血管平滑肌细胞的增殖和迁移［14-15］。因此，我们选择p38 MAPK通路初步探讨了PM2.5影响HVSMCs的作用机制，结果显示PM2.5刺激后HVSMCs胞内磷酸化p38 MAPK增多，与对照组比较差异有统计学显著性，说明PM2.5可激活p38 MAPK信号分子。本实验还选择了不同时点来观察p38 MAPK的活化情况，结果显示PM2.5染毒20 min时对p38 MAPK的活化作用最为明显。其它研究者在包括血管平滑肌细胞在内的多种细胞模型中也得到了类似的结果，并认为致病因子激活p38 MAPK是信号转导的上游事件，迅速激活的p38 MAPK转移至细胞核内引起细胞增殖、迁移和炎症因子表达等变化［8，16］。由于 PM2.5成分较为复杂，其可能通过与细胞膜受体结合或直接进入细胞内等多种方式来激活p38 MAPK分子，我们将在后继实验中分析并选取PM2.5的主要组分，对PM2.5激活p38 MAPK的具体途径此进行研究。

为了进一步证实p38 MAPK活化与PM2.5引起的HVSMCs增殖和迁移的关系，我们用特异性信号分子阻断剂SB203580预处理来阻断p38 MAPK通路，然后观察HVSMCs的增殖和迁移情况，结果显示SB203580预处理可以抑制PM2.5诱导的p38MAPK活化，同时SB203580预处理组HVSMCs的增殖和迁移受到明显抑制，通过上述两方面的结果，本研究最终证实p38 MAPK介导了PM2.5诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移过程。

综上所述，本实验证实大气污染物中的PM2.5可以促进HVSMCs细胞增殖和迁移能力，并证实p38 MAPK信号通路参与介导该过程，加深了对PM2.5的血管平滑肌细胞毒性及其致AS作用的认识，后续本课题组将从PM2.5如何激活p38 MAPK等方面深入研究其致心血管疾病的机理。