可溶性Klotho蛋白抑制THP-1源性泡沫细胞形成*

刘 玮， 李 琳， 刘佳妮， 石 晶， 洪 畋， 陈秀娟

（武汉市中心医院老年科，湖北武汉430014）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的重要病理基础，预防AS的形成是防治心血管病的根本措施。AS的基因治疗是目前研究的热点，但仍还处于起步阶段。调控AS发生发展的基因数量众多，机制复杂，因此寻找更多更有效的基因治疗靶点尤为重要。Klotho（KL）基因是Kuro-o等［1］在1997年发现的与衰老相关的新基因，KL基因敲除小鼠可呈现出类似人类衰老的各种表型，如寿命缩短、动脉硬化、不育症、骨质疏松、皮肤萎缩、肺气肿等［1］。大量研究表明，KL蛋白具有一定的抑制AS的作用［2-5］，但其具体机制尚不明确。

胆固醇的代谢异常将导致单核-巨噬细胞内胆固醇的蓄积，从而形成泡沫细胞，而泡沫细胞的形成是AS形成早期的标志性事件。KL蛋白可否调控泡沫细胞形成以及相关的分子机制目前国内外尚无相关报道。酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（acyl-coenzyme A：cholesterol acyltransferase 1，ACAT1）是细胞内唯一催化长链脂肪酸和游离胆固醇（free cholesterol，FC）酯化形成胆固醇酯（cholesterol ester，CE）的关键酶。而由ACAT1合成的CE在细胞内大量蓄集是动脉粥样硬化灶中泡沫细胞形成的主要特征。ATP结合盒转运体家族（ATP-binding cassette transporters，ABCs）中的ABCA1是调控细胞内胆固醇流出的关键因子［6］。本研究通过观察可溶性KL蛋白对THP-1源性巨噬细胞内胆固醇流出、THP-1源性泡沫细胞形成及ACAT1和ABCA1表达的影响，探讨可溶性KL蛋白是否通过调控ACAT1和ABCA1的表达，从而影响巨噬细胞内CE蓄积和胆固醇流出，抑制泡沫细胞形成，从而发挥抗AS的作用。

材料和方法

1 材料

THP-1单核细胞株购自ATCC。细胞胆固醇检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；油红O和［3H］-胆固醇（Sigma）；TRIzol（Ambion）；SYBR Green PCR试剂盒（KAPA Biosystems）；逆转录试剂盒（TaKaRa）；ACAT1及 ABCA1抗体（Abcam）；GAPDH抗体（CST）；氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔Ⅱ抗（Bioswamp）；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）购自Gene Operation。

2 方法

2.1 细胞培养及分组 THP-1细胞株按ATCC的说明进行培养和传代，加入含160 nmol/L PMA的低血清培养液，37℃、5%CO2培养48 h，观察细胞贴壁状态，确定THP-1单核细胞已诱导分化为巨噬细胞。换用含80 mg/L ox-LDL的低血清培养基继续培养48 h，观察泡沫细胞形成。细胞分为阴性对照组（THP-1巨噬细胞组）、阳性对照组（THP-1泡沫细胞组）和不同浓度KL蛋白组（THP-1源性巨噬细胞经25、50、100和200 μg/L［7］的重组KL蛋白预处理后2 h后，再按照THP-1泡沫细胞组程序操作）。

2.2 油红O染色 各组细胞均加入4%多聚甲醛固定10～15 min，加入油红O染液染色10 min，再用苏木素染液复染2～3 min，然后双蒸水冲洗并封片，在显微镜镜下观察，可观察到细胞内脂滴呈红色，而细胞核呈蓝色。

2.3 胆固醇流出率测定［8］THP-1细胞与［3H］标记的胆固醇共同孵育24 h后裂解细胞，用液体闪烁计数仪检测培养液和细胞裂解物中［3H］标记的胆固醇水平，胆固醇流出率（%）=培养液放射强度/（培养液放射强度+细胞裂解物放射强度）×100%（放射强度的单位为cpm，即min-1）。

2.4 细胞内总胆固醇（total cholesterol，TC）、FC及CE含量的测定 离心法收集各组细胞后，用PBS漂洗3次，用超声破碎细胞后，按细胞胆固醇检测试剂盒的说明操作，用酶荧光学法分别测定细胞内FC和TC的含量。CE为TC与FC的差值。CE占TC达到50%以上的细胞可认为已转变为泡沫细胞。

2.5 Western blot法检测ACAT1和ABCA1蛋白的表达 离心法收集各组细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，并用BCA法测定蛋白质的浓度，用9%SDSPAGE进行电泳分离，每孔上样量为20μg，然后进行转膜，封闭，加Ⅰ抗及HRP标记的Ⅱ抗，用ECL显影液进行荧光显色，然后将膜放置于全自动化学发光分析仪中进行检测。实验结果采用TANON GIS软件读取条带灰度值；将各组的ACAT1和ABCA1分别与相应GAPDH的面积灰度值进行比较，二者的比值代表ACAT1和ABCA1蛋白的表达。

2.6 RT-qPCR法检测ACAT1和ABCA1 mRNA的表达 收集各组细胞，按TRIzol试剂盒的说明提取总RNA，消除所提取的总RNA中的DNA及并除去DN-ase1后，取500 ng总RNA反转录合成cDNA，再取2.5μL反转录产物进行PCR循环。采用Real-Time System荧光定量PCR仪（BIO-RAD）进行反应。ACAT1的上游引物序列为5′-GCTGCTCTGGTTCTCAT-3′，下游引物序列为5′-GGCTTCATTTACTTCCC-3′，扩增片段大小195 bp；ABCA1的上游引物序列为5′-GAGGTTGCTGCTGTGGA-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-GGCATGGCTTTATTTGG-3′，扩增片段大小165 bp；βactin的上游引物序列为5′-TGCCCATCTACG-3′，下游引物序列为5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′，扩增片段大小153 bp。反应程序：95℃3 min；95℃5 s，56℃ 10 s，72℃ 25 s，39 cycles；65℃ 5 s；95℃ 50 s。数据采用仪器自带的qbase+软件分析。β-actin为内参照，运用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。ΔCt=Ct目的基因-Ct内参照；ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。

3 统计学处理

数据用均数±标准差（mean±SD）表示，采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，相关的浓度剂量效应关系采用线性相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 油红O染色观察可溶性KL蛋白对THP-1源性泡沫细胞形成的影响

油红O染色镜下观察，阴性对照组的细胞质内未见明显的红色脂滴，而在阳性对照组的细胞质内可观察到大量的红色脂滴，符合泡沫细胞的形态特点。与阳性对照组相比，不同浓度KL蛋白组中，随着可溶性KL蛋白浓度的增高，细胞质内红色脂滴数量呈现逐渐减少的趋势，见图1。

Figure 1.Lipid droplets in THP-1 cells detected by oil red Ostaining.A：negative control group（THP-1-derived macrophages）；B：positive control group（THP-1-derived foam cells in the presence of ox-LDL）；C～F：THP-1-derived macrophages were pretreated with soluble Klotho protein（25，50，100 and 200 μg/L）for 2 h，and then treated with ox-LDL for 48 h.The scale bar=20μm.图1 油红O染色观察各组细胞胞浆内脂滴的变化

2 可溶性KL蛋白对胆固醇酯合成的影响

酶荧光学法检测显示，阴性对照组细胞内CE/TC比值＜50%；而阳性对照组的CE/TC比值＞50%，符合泡沫细胞的生化特点；与阳性对照组相比，不同浓度KL蛋白组细胞内TC和CE的含量随着可溶性KL蛋白浓度的增高逐渐降低（相关系数r分别为-0.95和-0.96，均P＜0.05），当KL蛋白浓度为50、100和200μg/L时，CE/TC比值均小于50%，并且呈逐渐递减的趋势，见表1。

3 可溶性KL蛋白对胆固醇流出的影响

液体闪烁计数法显示，阳性对照组细胞胆固醇流出率与阴性对照组相比明显降低（P＜0.05）；与阳性对照组相比，不同浓度KL蛋白组随着可溶性KL蛋白浓度的增高，胆固醇流出率逐渐升高，当KL蛋白浓度为50、100和200μg/L时，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

4 可溶性KL蛋白对ACAT1和ABCA1蛋白表达的影响

阳性对照组的ACAT1蛋白表达与阴性对照组相比明显上调（P＜0.05）；不同浓度KL蛋白组与阳性对照组相比，随着KL蛋白浓度的增高，细胞内ACAT1蛋白表达逐渐降低（r=-0.92，P＜0.05），见图2。

与阴性对照组相比，阳性对照组ABCA1的蛋白表达显著降低（P＜0.05）；不同浓度KL蛋白组与阳性对照组相比，随着KL蛋白浓度的增高（从25μg/L到100μg/L），细胞内ABCA1蛋白表达逐渐增多（P＜0.05），而200μg/L KL组与100μg/L KL组相比，ABCA1蛋白表达的差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

表1 可溶性KL蛋白对各组细胞TC、FC和CE含量的影响Table 1.Effects of soluble Klotho（KL）protein on total cholesterol（TC），free cholesterol（FC）and cholesteryl ester（CE）in THP-1-derived macrophages（Mean±SD.n=3）

表2 可溶性KL蛋白对各组细胞胆固醇流出率的影响Table 2.Effects of soluble Klotho（KL）protein on cholesterol efflux of THP-1-derived macrophages（Mean±SD.n=3）

5 可溶性KL蛋白对ACAT1和ABCA1 mRNA表达的影响

阳性对照组ACAT1 mRNA的表达与阴性对照组相比显著上调（P＜0.05）；不同浓度KL蛋白组与阳性对照组相比，随着KL蛋白浓度的增高，细胞内ACAT1 mRNA的表达逐渐降低（r=-0.94，P＜0.05），见图3A。与阴性对照组相比，阳性对照组ABCA1 mRNA的表达显著降低（P＜0.05）；不同浓度KL蛋白组与阳性对照组相比，随着KL蛋白浓度的增高，细胞内ABCA1 mRNA的表达逐渐增多（r=0.88，P＜0.05），见图3B。

讨 论

胆固醇酯在巨噬细胞内大量蓄集并形成泡沫细胞是AS早期病变的典型病理特征。在AS的形成过程中，胆固醇代谢异常是一个重要环节，ACAT1和ABCA1在此环节中扮演了角色，ACAT1主要负责胆固醇酯的合成，而ABCA1主要负责胆固醇的流出。ACAT1是细胞内胆固醇酯合成的关键酶，调节着游离胆固醇和胆固醇酯之间的平衡。研究显示，在THP-1源性巨噬细胞中过表达ACAT1将促进泡沫细胞形成［9］，而ACAT1反义寡核苷酸及ACAT1抑制剂可抑制泡沫细胞形成［10］。ABCA1可介导细胞内磷脂和游离胆固醇转运至载脂蛋A1，从而促进高密度脂蛋白生成，启动胆固醇逆向转运过程，在机体清除多余脂质的过程中发挥重要作用［11-12］。

人类的KL基因可以通过不同的拼接方式选择性拼接而产生两种蛋白产物：分泌型KL蛋白和膜型KL蛋白。分泌型KL可以作为一种内分泌激素或内循环因子，通过细胞内信号转导通路调节相应的靶基因表达，从而发挥其生物学作用［13-14］。KL基因缺陷小鼠在4周龄大小就开始出现动脉粥样硬化的征象，并能随着增龄而逐渐加重。而将外源性KL基因转导入KL基因缺陷的小鼠体内后，其动脉粥样硬化程度可得到显著改善［15］。并且，体外转染外源性KL基因能减轻大鼠心肌细胞的缺血再灌注损伤［16］。Junsuke等［17］观察到KL可通过调节体内的氧化应激从而改善内皮细胞功能障碍。我们前期的研究也表明，老年冠心病患者的血浆KL蛋白水平与冠脉狭窄程度呈负相关［18］。上述研究表明，KL蛋白具有抑制动脉粥样硬化进程的作用。然而，KL蛋白抑制动脉粥样硬化的相关机制尚不明确，对泡沫细胞形成的影响及相关机制尚无相关报道。本研究分别从泡沫细胞的形成、细胞内胆固醇的流出、ABCA1及ACAT1蛋白质表达和mRNA表达水平探讨了可溶性KL蛋白对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成中ABCA1和ACAT1表达的影响。实验结果表明，在ox-LDL的刺激下，发生THP-1巨噬细胞的泡沫化（阳性对照组），ACAT1蛋白及mRNA表达均显著增加，而ABCA1蛋白及mRNA表达均显著降低。加入外源性的可溶性KL蛋白后，随着可溶性KL蛋白浓度的升高，THP-1巨噬细胞泡沫化的程度逐渐减轻，胆固醇的流出逐渐增加。且可溶性KL蛋白能够呈浓度依赖性的抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成过程中，ACAT1蛋白及mRNA表达的上调以及ABCA1蛋白及mRNA表达的下调，说明可溶性KL蛋白作为一种内循环因子，可能通过调控巨噬细胞内ACAT1及ABCA1的表达，进而减少细胞内胆固醇的蓄积，抑制THP-1源性泡沫细胞形成。

Figure 2.The protein expression of ACAT1 and ABCA1 in each group detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs negative control group；#P＜0.05 vs positive control group.图2 Western blot检测各组ACAT1和ABCA1的蛋白表达

Figure 3.The mRNA expression of ACAT1（A）and ABCA1（B）in each group detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs negative control group；#P＜0.05 vs positive control group.图3 RT-qPCR检测各组ACAT1和ABCA1的mRNA表达

综上所述，ACAT1和ABCA1是调节细胞内胆固醇代谢的2个关键蛋白，分别调控胆固醇的合成和流出，可溶性KL蛋白通过抑制ACAT1表达，促进ABCA1表达，抑制细胞内胆固醇酯的蓄积，增加胆固醇的流出，进而阻碍泡沫细胞的形成，抑制AS的发生、发展。我们初步探讨了在体外细胞实验中，能否通过加入外源性分泌型KL基因的方法，从转录水平调控ABCA1和ACAT1的表达，从而抑制泡沫细胞形成。