CCR9、CCL25在子宫内膜异位症患者异位子宫内膜组织中的表达变化及意义

何玉凤，李桂林徐州医科大学，江苏徐州000；徐州医科大学附属徐州妇幼保健院

子宫内膜异位症(EMT)是一种常见的妇科良性慢性炎症性疾病，指子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫体以外的部位生长，可侵犯全身任何部位，以卵巢、宫骶韧带最常见，其主要临床表现为痛经、慢性盆腔痛、不孕及性交不适等[1]。育龄妇女EMT发病率10%～15%，且近年来其发病率呈明显上升趋势[2]。该病虽为良性疾病，但其具有恶性肿瘤的特点，如种植、侵袭、远处转移及复发等。研究证实，趋化因子或趋化因子受体(CCR)是慢性炎症和许多自身免疫性疾病的潜在致病因素[3]。国内研究结果显示，CCR4、CCR8、CCR9、CXC类趋化因子受体1(CXCR1)在EMT异位灶中高表达，可能参与EMT的发展[4]。进一步研究[5]发现，CCR9可能通过改变子宫内膜生物学性状，参与异位灶局部的免疫耐受及EMT的发生发展。而CCR9的惟一配体为趋化因子受体配体25(CCL25)，两者通常相互作用参与疾病发生发展。本研究探讨CCR9、CCL25在EMT患者异位子宫内膜组织中的表达变化及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月～2019年6月在徐州市妇幼保健院妇科住院的EMT患者55例(EMT组)，行腹腔镜、宫腔镜手术治疗，且经术后病理检查确诊。患者年龄23～49岁；月经周期(30.51±2.64)d，月经持续时间(5.58±1.12)d；卵巢型EMT 44例、深部浸润型EMT 11例；按1997年修订的美国生育学会分期标准，EMT分期Ⅰ期(微型，1～5分)7例、Ⅱ期(轻型，6～15分)17例、Ⅲ期(中型，16～40分)28例、Ⅳ期(重型，40分以上)3例；子宫内膜增殖期32例，分泌期23例。纳入标准：符合《妇产科学》第9版中EMT的诊断标准，并经腹腔镜、宫腔镜手术及术后病理检查确诊；术前6个月内未接受过激素类药物治疗；无其他严重器质性病变。排除标准：妊娠期、哺乳期；妇科恶性肿瘤。选取同期子宫肌瘤、单纯卵巢囊肿、子宫内膜息肉等非EMT患者35例为对照组，均经术后病理检查确诊。患者年龄24～48岁；月经周期(30.66±2.70)d，月经持续时间(5.80±1.02)d；子宫内膜增殖期20例，分泌期15例。两组年龄、月经周期、月经持续时间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究经徐州市妇幼保健院伦理委员会批准，两组均签署知情同意书。

1.2 标本收集方法 术中收集对照组正常子宫内膜及EMT组在位内膜、异位内膜组织，经生理盐水冲洗和纱布蘸干后，将部分标本置于10%甲醛缓冲溶液固定，常规脱水、石蜡包埋；另取部分标本置于液氮中保存，根据术后病理检查结果标记并保存于-80 ℃冰箱中保存。

1.3 两组子宫内膜组织中CCR9、CCL25蛋白表达检测 采用免疫组化法。取包埋蜡块做成连续切片，厚度4 μm，随机选取4张切片做免疫组化染色。常规脱蜡水化，3%过氧化氢浸泡玻片10 min，去除过氧化物干扰，PBS水冲洗后置于抗原修复液中微波处理至沸腾，移至95 ℃水浴30 min；加一抗CCR9兔多克隆抗体/CCL25兔单克隆抗体(abcam公司)4 ℃过夜；加生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min；DAB显色，光学显微镜下观察显色效果，及时终止显色；常规复染、返蓝、脱水及封片；光学显微镜下观察并拍照。结果判定标准：细胞膜与细胞质染色为棕黄色或棕褐色为CCR9、CCL25蛋白表达阳性的细胞。根据参考文献[6]对细胞染色强度进行评分：无染色为0分，浅棕黄色为1分，呈现棕黄色为2分，棕褐色为3分。每张切片选择10个视野进行评分，计算平均值。

1.4 两组子宫内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法。取组织标本各30 mg，剪碎，加入TRIzol(Vazyme公司)200 μL，经超声研磨碎裂；加TRIzol 800 μL混匀，室温静置5 min；加入氯仿200 μL，充分混匀；经4℃ 12 000 g离心15 min后取上清液；加入异丙醇500 μL，混匀、静置10 min；经4 ℃ 12 000 g离心10 min后弃上清液，吸干，加75%乙醇1 mL混匀；经4 ℃ 7 500 g离心5 min后弃上清液，吸干，经4 ℃ 5 000 g离心3 min后弃上清液，吸干，静置至乙醇完全挥发；加入DEPC水66 μL混匀；用Nanodrop 2000微量紫外线分光光度计检测RNA在260、280 nm处的纯度和浓度，获得总RNA；再按照Vazyme公司提供的Hiscript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)说明书进行操作，获得cDNA置于-20 ℃保存。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计，以GAPDH作为内参。CCR9正向引物序列为5′-TCCTCTTTCTTGTCACTCTTCC-3′，反向引物序列为5′-CAACACACAGCTGTAGAAGTTC-3′；CCL25正向引物序列为5′-TATTCTACCTCCCCAAGAGACA-3′，反向引物序列为5′-GATGGGATTGCTAAACTTGGAC-3′；GAPDH正向引物序列为5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物序列为5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。严格按照康为世纪公司提供的UItraSYBR Mixture说明书进行操作，经Roche LightCycler 480 PCR仪检测获得数据。采用2-ΔΔCt法计算目标基因相对表达量。

2 结果

2.1 两组子宫内膜组织中CCR9、CCL25蛋白的表达 EMT组异位内膜组织、在位内膜组织中CCR9、CCL25蛋白相对表达量均高于对照组正常子宫内膜组织(P均<0.05)，且EMT组异位内膜组织中CCR9、CCL25蛋白相对表达量高于在位内膜组织(P均<0.05)，见表1。EMT组不同分期异位内膜组织中CCR9、CCL25蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(P均<0.05)，见表2。EMT组浸润型内膜组织中CCR9、CCL25蛋白相对表达量高于卵巢型内膜组织(P<0.05)，见表3。

表1 两组子宫内膜组织中CCR9、CCL25蛋白表达比较

表2 EMT组不同分期异位内膜组织中CCR9、CCL25蛋白表达比较

表3 EMT组不同分型异位内膜组织中CCR9、CCL25蛋白表达比较

2.2 两组子宫内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA的表达 EMT组异位内膜组织、在位内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA相对表达量均高于对照组正常子宫内膜组织(P均<0.05)，且EMT组异位内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA相对表达量高于在位内膜组织(P均<0.05)，见表4。EMT组不同分期异位内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA相对表达量比较差异有统计学意义(P均<0.05)，见表5。EMT组浸润型内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA相对表达量高于卵巢型内膜组织(P<0.05)，见表6。

表4 两组子宫内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA表达比较

表5 EMT组不同分期异位内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA表达比较

表6 EMT组不同分型异位内膜组织中CCR9、CCL25 mRNA表达比较

3 讨论

EMT是一种极其复杂的疾病，病因及发病机制尚未完全阐明，因此探讨其发生发展机制成为目前研究热点。EMT的发病机制主要为经血逆流学说，同时内分泌、免疫炎症、遗传、局部微环境等多种因素可能参与其中[7]。研究表明，炎症反应、免疫异常是其发病的病理基础，特定细胞黏附、侵袭、促使血管生成是其发生发展的基本环节[8]。EMT根据异位病灶部位分为卵巢型、腹膜型、深部浸润型及其他部位型。卵巢最易被异位内膜侵犯，是最典型的EMT类型。而深部浸润型EMT是EMT的一种特殊类型，是指病灶浸润深度≥5 mm，可累及盆腔不同部位，主要位于后盆腔，累及部位如宫骶韧带、直肠子宫陷凹、阴道穹隆、阴道直肠隔及结直肠壁等[9]。深部浸润型EMT的主要临床症状为疼痛、不孕，疼痛包括痛经、慢性盆腔痛、深部性交痛及消化泌尿系统相关的疼痛等。近年来，其发病率在逐渐升高，患者趋向年轻化，严重影响患病女性的生活和工作[10]。目前临床上深部浸润型EMT疼痛的治疗主要以手术为主，但手术难度高、安全性难保证，且术后存在并发症。

近年来，趋化因子及其受体在EMT发生发展中的作用逐渐受到重视。趋化因子是一类能趋化特定细胞定向迁移的低分子分泌蛋白，由70～100个氨基酸组成，根据其分子N末端半胱氨酸残基的数目及结构排列可分为4个亚科[11]：CC类、CXC类、XC类、CX3C类。CCR是一类介导趋化因子行使特定功能的GTP-蛋白偶联的跨膜受体，通常表达于多种细胞表面(免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上)，可分为四个亚家族[12]：CCR、CXC类受体(CXCR)、C类受体(XCR)和CX3C类受体(CX3CR)。研究证实，EMT患者盆腹腔内环境中多种趋化因子表达水平升高，并与该疾病严重程度有着密切联系[13～15]。CCR9在EMT患者异位灶中的表达高于正常子宫内膜[16，17]。研究表明，CCR9主要表达于未成熟T细胞上，如双阳性T细胞、肠道相关T细胞等，CCR9可通过CCL25刺激T细胞发育，进行组织特异性归巢[18]。CCL25为CCR9的惟一配体，也被证实是EMT发病和进展的重要危险因素[5]。但相关研究均未从临床角度研究二者表达变化。

本研究免疫组化法检测结果显示，CCR9、CCL25蛋白在异位内膜组织中表达高于在位内膜及正常子宫内膜，而其在位内膜表达量高于正常子宫内膜，验证了国内外学者的研究[16，17]结果。另外，CCR9、CCL25蛋白在不同分期EMT患者的异位内膜组织中的表达量差异有统计学意义，可见随着病情严重程度增加而CCR9、CCL25蛋白表达量升高，且CCR9、CCL25蛋白在深部浸润型异位灶表达量高于卵巢型异位灶。同时，进一步用RT-qPCR法检测，获得的结果与免疫组化结果一致。相关研究证实，CCL25通过其受体CCR9趋化淋巴细胞聚集至病变结肠，并进一步激活淋巴细胞，最终导致Th2介导的肠道黏膜炎症，即CCL25和CCR9异常表达及其相互作用参与调节结肠炎症反应[19，20]。

综上所述，CCR9、CCL25在EMT患者异位内膜组织中呈高表达，且二者的表达与EMT分期、分型有关。CCR9、CCL25随着EMT病变的加重而表达量增加，二者可能促进EMT的发生进展。但本研究所选样本较为典型，仅论证了CCR9、CCL25在卵巢型及深部浸润型异位灶中的表达；本研究缺乏合并肠道相关性疾病的患者，下一步需将其纳入研究，为深部浸润型EMT发病机制的研究提供新思路。