α-硫辛酸对波动性高糖诱导乳鼠雪旺细胞损伤的影响及机制

齐灵铄，李继扬，王倩倩，孙连庆西安交通大学第一附属医院，西安7006；2吴起县人民医院；中国电子科技集团公司第二十研究所职工医院

近年来人们越来越重视血糖波动在糖尿病各种慢性并发症发病中的作用。如何有效避免血糖波动对靶器官的损伤成为糖尿病研究领域的热点之一[1]。研究表明，波动性高糖较稳定性高糖更易导致糖尿病各种慢性并发症的发生，其机制可能与氧化应激、炎性因子激活、凝血机制的活化等有关[2～5]。随着糖尿病血管并发症发生发展统一机制学说的提出，抗氧化应激治疗已成为防治糖尿病并发症的重要手段[6]。α-硫辛酸(ALA)作为一种具有超强抗氧化能力的药物已被广泛应用于糖尿病周围神经病变(DPN)的治疗，但ALA对波动性高糖条件下周围神经重要靶细胞——雪旺细胞(SC)的保护作用及可能的机制尚缺乏研究。2018年1月～2019年3月，本研究以SC为观察对象，探讨ALA对波动性高糖所致SC损伤的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 清洁级Wistar乳鼠，雄性，鼠龄3～5 d，体质量(6.4±1.1)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2009-0007。细胞培养箱(德国Heraeus SEPATECH公司)；流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)；DU640分光光度仪(美国Backman公司)ALA(德国史达德药厂)；DMEM细胞培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；G-418(美国Sigma公司)；兔抗鼠S-100多克隆抗体、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)；JC-1荧光探针(北京嘉美生物有限公司)；丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物有限公司)；TUNEL凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)；兔抗鼠anti-B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、anti-Bcl-2相关X蛋白(bax)、anti-细胞色素C(cyto C，美国Santa Cruz公司)，兔抗鼠anti-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)、anti-caspase-3(美国CST公司)。

1.2 SC的培养、纯化及鉴定 将脱颈处死的乳鼠浸泡消毒10 min，无菌分离坐骨神经后充分剪碎，组织贴块法培养，双差速贴壁法进一步去除成纤维细胞，用G-418纯化，用S-100蛋白进行SC鉴定。纯化后的SC呈梭型或双极状，核呈卵圆形，胞体饱满，突起细长，呈现“端对端”“极对极”的网状或旋涡状，排列规律。经S-100抗体进行免疫组化染色后，计算SC的纯度达95%以上。选择生长良好的第3代SC进行实验。

1.3 细胞分组与干预 根据课题组前期研究[7]，选择50 mmol/L作为高糖浓度，5.6 mmol/L为正常糖浓度，干预时间48 h。无血清培养基同步化处理SC后进行分组培养：正常对照组给予含5.6 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基；稳定性高糖组给予含50 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基；波动性高糖组给予含5.6 mmol/L葡萄糖的DMEM与50 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基交替培养，每8 h更换培养液；低、中、高浓度ALA组给予含5.6 mmol/L葡萄糖的DMEM与50 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基交替培养，每8 h更换培养液，分别加入50、100、200 μmol/L ALA进行处理。

1.4 细胞培养上清液MDA、SOD检测 用ELISA法进行检测。收集各组细胞培养液，离心后取上清液，按照试剂盒说明书进行检测。

1.5 线粒体膜电位(MMP)检测 各组细胞重悬于JC-1工作液0.5 mL中，37 ℃避光孵育1 h，3～5 min颠倒混匀，使细胞和探针充分接触。JC-1染色缓冲液重悬细胞后，用流式细胞仪分别检测10 000个细胞的红绿荧光强度。MMP=红荧光强度/绿荧光强度。

1.6 细胞凋亡率检测 采用TUNEL法。接种于多聚赖氨酸包被盖玻片的SC用4%多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100打孔，滴加TUNEL反应液后避光孵育。DAB显色后镜下观察，出现棕黄色颗粒后立即终止反应，光学显微镜下观察并采集图片。SC核呈深棕黄色圆形或椭圆形颗粒者为阳性，每组随机选取5个视野，通过凋亡细胞数/总细胞数计算凋亡率。

1.7 细胞内蛋白表达检测 采用Western blotting法。裂解得到各组细胞蛋白，定量、调整浓度，将样品经电泳、转膜后室温封闭1 h，分别加入兔抗鼠Bcl-2(1∶200)、bax(1∶200)、cyto C(1∶200)，活化型caspase-9(cleaved-caspase-9,1∶800)、cleaved-caspase-3(1∶800)多克隆抗体4 ℃过夜，HRP标记的二抗室温孵育，ECL显色后曝光显影。以β-actin或MnSOD作为内参。用Image Tool软件测定杂交条带光密度值。

2 结果

2.1 各组培养液中MDA、SOD水平比较 与正常对照组、稳定性高糖组比较，波动性高糖组细胞培养液中MDA水平高(P均<0.01)，SOD水平低(P均<0.05)。与波动性高糖组比较，各ALA组培养液中MDA水平低(P均<0.05)，SOD水平高(P均<0.01)。低、中、高浓度ALA组培养液中MDA水平均依次降低(P均<0.05)，SOD水平均依次增高(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组凋亡率比较 与正常对照组、稳定性高糖组比较，波动性高糖组SC凋亡率高(P均<0.05)。与波动性高糖组比较，各ALA组SC凋亡率低(P均<0.05)。低、中、高浓度ALA组凋亡率均依次降低(P均<0.05)。见表1。

2.3 各组MMP比较 与正常对照组、稳定性高糖组比较，波动性高糖组MMP低(P均<0.05)。与波动性高糖组比较，各ALA组MMP组高(P均<0.05)。低、中、高浓度ALA组MMP依次增高(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞培养液中MDA水平、SOD水平及细胞凋亡率、MMP比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与稳定性高糖组比较，cP<0.05，dP<0.01；与波动性高糖组比较，eP<0.05，fP<0.01；与低浓度ALA组比较，gP<0.05；与中浓度ALA组比较，hP<0.05。

2.4 各组细胞内蛋白表达比较 与正常对照组比较，稳定性高糖组、波动性高糖组细胞内Bcl-2蛋白相对表达量低(P均<0.05)，bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白相对表达量高(P均<0.05)。与波动性高糖组比较，各ALA组细胞内Bcl-2蛋白相对表达量高(P均<0.05)，bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白相对表达量低(P均<0.05)。见表2。与正常对照组、稳定性高糖组比较，波动性高糖组线粒体内cyto C表达低(P均<0.05)，胞质中cyto C表达高(P均<0.05)。与波动性高糖组比较，各ALA组线粒体cyto C表达高(P均<0.05)，胞质中cyto C表达低(P均<0.05)。见表3。

表2 各组细胞蛋白相对表达量比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与稳定性高糖组比较，bP<0.05；与波动性高糖组比较，cP<0.05；与低浓度ALA组比较，dP<0.05；与中浓度ALA组比较，eP<0.05。

3 讨论

如何有效预防高血糖引起的各种慢性并发症的发生是目前糖尿病治疗的重要目标。糖尿病患者的高血糖状态并不稳定，因机体自身调控系统的异常会导致大多数糖尿病患者出现大幅度的血糖波动。糖化血红蛋白水平相近的2型糖尿病患者，如血糖波动幅度的增加，则其发生慢性并发症的风险增高，预后也差[8]。研究显示，波动性高糖可通过触发氧化应激通路和激活信号转导途径，从而更快启动内皮细胞凋亡程序，导致更严重的内皮功能障碍[9,10]。

表3 各组细胞线粒体及胞质内cyto C蛋白相对表达量比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与稳定性高糖组比较，bP<0.05；与波动性高糖组比较，cP<0.05；与低浓度ALA组比较，dP<0.05；与中浓度ALA组比较，eP<0.05。

SC是髓鞘形成细胞，对周围神经结构功能的维持及损伤修复起着重要作用。由于线粒体含量丰富，而且细胞内负责转运葡萄糖的受体属非胰岛素依赖性，因此高血糖易导致SC线粒体的氧化应激损伤，继之出现MMP下降，cyto C从线粒体膜间腔释放到胞质中活化，从而启动细胞凋亡信号，结合caspase-9后激活caspase-3，通过线粒体途径导致细胞凋亡。

目前认为波动性高血糖比慢性稳定性高血糖更能促进糖尿病各种慢性并发症的发生。本研究建立波动性高糖诱导的SC损伤模型，并观察细胞氧化应激水平及线粒体凋亡通路的变化。结果显示稳定性高糖和波动性高糖条件下，SC的氧化应激水平明显增高，表现为MDA水平升高，SOD水平下降。同时稳定性高糖和波动性高糖降低了MMP，促进了cyto C从线粒体到胞质的转位，下调Bcl-2蛋白表达，上调bax蛋白表达，提高了caspase-9及caspase-3的活化水平，从线粒体途径增加了SC凋亡。与稳定性高糖相比，波动性高糖的损伤作用更为明显。

波动性高糖比稳定性高糖更容易导致细胞损伤的具体机制尚不明确。长期高浓度葡萄糖环境会诱导细胞发生代偿性改变，从而使细胞的代谢反应能适应高糖所带来的损伤。当外界环境的葡萄糖浓度不断发生变化时，细胞的这种适应性和反馈性调控作用被削弱，从而发生更为严重的功能损伤[2～4]。

ALA作为一种具有强抗氧化能力的生物抗氧化剂，多年来一直在临床上广泛应用于DPN的治疗。临床研究结果表明，ALA可显著改善DPN患者的神经传导速度及神经障碍评分，具有良好的神经保护作用[11]。本研究中，ALA可降低SC的MDA水平，提高SOD水平，从而改善了波动性高糖所导致的SC氧化应激损伤。同时ALA可提高MMP，抑制cyto C从线粒体到胞质的转位，下调bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，降低了caspase-9及caspase-3的活化，通过线粒体途径抑制波动性高糖所导致的SC凋亡。

综上所述，波动性高糖对SC有明确的损伤作用，且波动性高糖较稳定性高糖对SC的损伤更为严重，这种作用可以加速DPN的进展。因此，有效控制血糖波动对DPN的治疗具有重要意义。抗氧化剂ALA对波动性高糖损伤的SC具有明显的保护作用，这与其显著改善氧化应激，从线粒体途径抑制SC的凋亡有关，从机制上进一步验证了ALA的神经保护作用。