西罗莫司对心肌梗死大鼠心肌纤维化的治疗作用及其机制

陈俊文，刘益，钟伟宏香港大学深圳医院，广东深圳58000；深圳市妇幼保健院

心肌梗死是临床常见病，心肌梗死后患者会有不同程度的顺应性心脏重构和心力衰竭[1]。心肌纤维化、炎症、细胞凋亡和血管内皮功能障碍是心肌梗死后心脏重构的典型特征[2]。心肌纤维化以细胞外基质(ECM)胶原分泌增加，降解减少，胶原比例失调为主要特征的病理变化，过度心肌纤维化可改变心肌的收缩性和传导性，从而促发心力衰竭和心律失常[3]。转化生长因子β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β参与的炎症反应在心肌纤维化和心脏重构中发挥重要作用[4]。西罗莫司是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂，研究显示其具有抗肿瘤作用和免疫抑制活性[5]。西罗莫司对神经纤维瘤、结肠癌、宫颈癌等多种实体肿瘤都有抑制作用[6]。西罗莫司还可抑制碱性成纤维细胞生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞和小鼠胚胎成纤维细胞系的增殖[7]。但西罗莫司对大鼠心肌纤维化的作用尚不清楚。2018年8月～2019年10月,本研究对此作了观察，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 8周雄性SD大鼠45只，体质量250～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。西罗莫司购自Pfizer Ireland Pharmaceuticals；Masson染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Ⅰ型胶原(ab34710)、Ⅲ型胶原(ab7778)、TGF-β1(ab92486)抗体、Smad7(ab216428)抗体均购自美国Abcam公司；磷酸化Smad2(p-Smad2，S465/S467，#18338)抗体购自美国CST公司。HRP标记的山羊抗兔二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔二步法检测试剂盒(兔增强聚合物法检测系统，pv9001)、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PVDF膜、ECL发光液均购自密理博(上海)贸易有限公司。

1.2 动物分组及模型制备 将SD大鼠随机分为对照组、模型组、西罗莫司组各15只。用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠，对照组暴露冠状动脉左前降支用结扎线只穿过不结扎，然后逐层缝合伤口。模型组、西罗莫司组结扎冠状动脉左前降支制备心肌梗死模型，逐层缝合伤口。西罗莫司组术后给予西罗莫司2 mg/(kg·d)灌胃治疗[8]，对照组、模型组给予等量生理盐水灌胃。均连续给药4周。

1.3 心脏功能检测 给药结束后，按前述方法将大鼠麻醉，用彩色多普勒超声仪获得心脏M-超声心动图。记录大鼠左室收缩末期直径(LVESD)、左室舒张末期直径(LVEDD)、左室短轴缩短率(LVFS),并计算各组大鼠左室射血分数(LVEF)。

1.4 取材 用断头法处死大鼠，剪开其胸腔取出心脏，用生理盐水冲洗组织，取部分保存于液氮中用于提取总蛋白；剩余组织用4%多聚甲醛固定，行脱水石蜡包埋，制成4 μm厚的切片，用于后续染色。

1.5 大鼠心肌胶原容积分数(CVF)测算 采用Masson染色法。切片常规脱蜡至水，用配制好的Weigert铁苏木素染色5～10 min。用酸性乙醇分化，Massson返蓝液返蓝，丽春红品红染色5 min，磷钼酸分化，苯胺蓝染色1～2 min。乙醇梯度快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察胶原纤维呈蓝色，心肌组织呈红色，胞核呈黑蓝色。每张切片随机选取5个视野并拍照，图像用Image pro plus6.0软件进行分析，计算胶原纤维染色面积占切片总面积的百分比，即CVF。

1.6 大鼠心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达检测 采用免疫组化法。心肌组织切片常规脱蜡至水，用柠檬酸盐缓冲液(pH值6.0)进行抗原修复(微波大火5 min，小火15 min)，3%过氧化氢清除内源性过氧化物酶活性，3%的BSA室温封闭30 min，把湿盒放在4 ℃孵育一抗Ⅰ型胶原(1∶100)、Ⅲ型胶原(1∶500)过夜。第2天按照兔二步法检测试剂盒说明书孵育二抗，DAB显色。苏木素复染、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜观察并随机选取5个视野拍照。用Image J-plugins-IHC profiler对图片进行定量分析，计算蛋白表达阳性细胞百分比。

1.7 大鼠心肌组织中TGF-β1及Smad2、7蛋白表达检测 采用Western blotting法。将保存于液氮中的心肌组织研磨并用蛋白裂解液裂解，BCA法测总蛋白浓度，用上样缓冲液100 ℃煮蛋白5 min使其变性。取50 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜封闭后，4 ℃孵育一抗TGF-β1(1∶500)、Smad7(1∶500)、p-Smad2(1∶1 000)过夜，第2天孵育HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，用Bio-Rad凝胶成像系统进行ECL发光实验。用Image J进行灰度值计算，用β-actin作内参。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 结果

2.1 西罗莫司对心肌梗死大鼠心功能的影响 与对照组比较，模型组LVESD、LVEDD高(P均<0.05)，LVFS、LVEF低(P均<0.05)。与模型组比较，西罗莫司组LVESD、LVEDD低(P均<0.05)，LVFS、LVEF高(P均<0.05)。见表1。

表1 各组心功能指标比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 西罗莫司对心肌梗死大鼠心肌胶原纤维含量的影响 对照组、模型组、西罗莫司组CVF分别为(4.6±1.03)%、(16.5±3.29)%、(9.3±2.45)%。与对照组比较，模型组CVF高(P<0.05)；与模型组比较，西罗莫司组CVF低(P<0.05)。

2.3 西罗莫司对心肌梗死大鼠心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响 对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白阳性细胞百分比分别为(14.6±2.38)%、(11.6±2.20)%，模型组分别为(63.3±3.29)%、(55.0±1.37)%，西罗莫司组分别为(33.3±1.78)%、(28.0±1.59)%。与对照组比较，模型组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白阳性细胞百分比高(P均<0.05)；与模型组比较，西罗莫司组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白阳性细胞百分比低(P均<0.05)。

2.4 西罗莫司对心肌梗死大鼠心肌组织中TGF-β1/Smad通路的影响 与对照组比较，模型组TGF-β1、p-Smad2蛋白相对表达量高(P均<0.05)，Smad7蛋白相对表达量低(P<0.05)。与模型组比较，西罗莫司组TGF-β1、p-Smad2蛋白相对表达量低(P均<0.05)，Smad7蛋白相对表达量高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2及Smad7蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

心脏受损伤后再生能力非常有限，失去的细胞会被纤维化瘢痕所取代[9]。随之而来的是周围心肌的重构，最终导致心功能受损。重构过程包括左心室壁增厚(肥厚)和变硬(纤维化)[10]。然而，心肌梗死后增加的机械应力以及激素和旁分泌的细胞因子，也会导致梗死远端结缔组织扩张。梗死边缘区和远端未损伤心肌的这种反应性纤维化导致心室顺应性改变和心室硬度增加，从而危及心输出量[11]。除了对心脏收缩力的影响外，纤维瘢痕和间质纤维化也会干扰心脏正常的电功能，从而诱发心律失常[12]。因此，心肌纤维化已被确定为心力衰竭的一个独立危险因素，可使心力衰竭患者发生心脏性猝死，并独立于射血分数而增加总体病死率[13]。

心肌纤维化是指心肌间质中胶原纤维过度堆积，各类胶原比例失调，胶原纤维排列紊乱。肌成纤维细胞产生大量的间质胶原(最初是Ⅲ型胶原，后来在梗死愈合过程中产生Ⅰ型胶原)[14]。结扎大鼠冠状动脉左前降支能引起大鼠心肌梗死，4周后会形成明显的心肌纤维化，此模型已经被广泛应用于心肌纤维化机制的研究。本研究应用此方法成功诱导了大鼠心肌纤维化模型，心肌梗死术后4周大鼠心脏LVESD、LVEDD都明显升高，LVEF显著降低；心肌间质胶原明显增加，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量均增加。以上符合心肌纤维化的病理特征。

西罗莫司是一种有效抑制抗原诱导的T细胞、B细胞增殖和抗体产生的抑制剂，可用作器官移植中的免疫抑制剂[15]。西罗莫司与细胞内蛋白形成免疫抑制复合物，阻断了细胞周期特异性激酶(TOR)的激活。TOR失活后的下游反应导致细胞周期在G1期和S期交界处受阻[16]。有研究认为，西罗莫司的抗真菌、抗增殖和免疫抑制作用的分子机制是相同的[17]。西罗莫司可减轻单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化[8]。本研究在心肌梗死术后每天给予大鼠西罗莫司灌胃治疗，第28天测心功能发现，西罗莫司组大鼠心功能较模型组明显改善，CVF明显降低，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量均下降。可见，西罗莫司可以减轻心肌梗死导致的心肌纤维化。

TGF-β1属于TGF-β超家族，是调节基质沉积的关键因子，在细胞分化、免疫抑制、增殖、炎症、组织重构和伤口愈合中发挥重要作用[18]。研究表明，TGF-β1通路可以刺激血管内膜增生和纤维化[19]。TGF-β1通路是由TGF-β1结合Ⅱ型TGF-β受体，导致TβR-I丝氨酸磷酸化和激活。激活的TβR-I反过来促进Smad2、Smad3丝氨酸位点的磷酸化，使其与Smad4结合介导TGF-β信号从胞质转到胞核，从而转录纤维化相关基因[20，21]。MADH/Smad7是TGF-β1信号转导的拮抗剂，已有研究证明，MADH/Smad7可抑制TGF-β1激活，从而阻止Smad2通路[22]。本研究中，心肌梗死组织中TGF-β1和p-Smad2蛋白表达升高。提示在心肌梗死模型中TGF-β1/Smad通路被激活，从而引起心肌纤维化。西罗莫司组TGF-β1、p-Smad2蛋白表达降低，Smad7蛋白表达升高，提示西罗莫司可能通过抑制TGF-β1/Smad通路激活减少心肌胶原沉积，从而抑制心肌纤维化。

综上所述，西罗莫司治疗能改善心肌梗死大鼠心功能，减少胶原沉积，抑制心肌纤维化。其机制可能与抑制TGF-β1/Smad通路激活有关。