流动相对西罗莫司异构体在反相液相色谱上分离效果影响的研究*

郑权，李萍，储照伟，樊瑜波,2△

(1.北京航空航天大学 生物与医学工程学院 生物力学与力生物学教育部重点实验室，北京 100191；2.国家康复辅具研究中心，北京 100176)

1 引 言

西罗莫司(Sirolimus)，又名雷帕霉素(Rapamycin)，是从吸水性链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的培养液中分离出来的一种天然抗生素[1]。西罗莫司具有免疫抑制与抗平滑肌细胞增殖等功能，其载药洗脱支架可明显降低冠心病介入治疗后的再狭窄率，且治疗效果直接依赖于西罗莫司的释放动力学[2]。因此，体外药物释放动力学的测定是西罗莫司洗脱支架质量控制的强制性要求。同时，在西罗莫司的体外释放动力学基础上，结合人体冠脉的血流动力学[3]与物质在人体血管中的传输模型[4]，通过计算流体力学方法，可间接获得西罗莫司在人体冠脉组织的浓度分布，从而解决了无法直接测试人体冠脉组织中药物浓度分布的难题[5-6]。准确测试西罗莫司洗脱支架的体外药物释放动力学对于质量控制与冠脉组织内药物分布的建模具有非常重要的意义。

西罗莫司的分子结构非常复杂，它是由31元环组成的大环三烯内酯化合物，且含有15个立体异构中心，导致西罗莫司在溶液中存在构象异构体[7]。在高效液相色谱的谱图上，西罗莫司的异构体可能出现3个色谱峰(按照洗脱时间的先后顺序)：α峰含量极微，低于1%；β峰是主峰，约占92%；γ峰是次峰，约占7%[8]。为了使高效液相色谱法能够准确测定西罗莫司的含量，需要将β峰与γ峰完全分离[9]。虽然目前广泛采用高效液相色谱法测定西罗莫司的含量[10-13]，但只有少数文献报道了西罗莫司异构体在高效液相色谱上的分离效果：采用反相色谱柱，在合适的柱温下，以一定比例的水/甲醇[8]或水/乙腈[9]作流动相能够分离西罗莫司异构体。由于流动相可能对西罗莫司异构体的分离效果具有显著的影响；同时，与色谱柱和柱温相比，流动相种类与比例的选择更为多样化与灵活，可方便用于西罗莫司异构体最佳分离条件的优化。目前还没有文献深入讨论不同流动相对西罗莫司异构体分离效果的影响。本研究在色谱柱与柱温都相同的实验条件下，对比研究水/乙腈与水/甲醇作为流动相对西罗莫司异构体分离效果的影响，以期找到一种快速且高效分析西罗莫司的液相色谱方法。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

美国Waters 600高效液相色谱仪包括：四元溶剂梯度输送泵，Waters 2487双波长吸收检测器，Empower色谱软件管理系统。反相色谱柱是日本YMC J’sphere ODS-H80，色谱柱的规格是4.6 mm × 250 mm。色谱柱恒温箱采用HT-220A(天津恒奥公司)。色谱纯甲醇与乙腈均购自天津四友公司。西罗莫司由福建科瑞药业有限公司提供。实验用水为超纯水。

2.2 实验方法

参照文献所使用的柱温[10-13]，结合色谱柱厂家说明书所推荐的温度范围，色谱柱的温度设为50°C。色谱流动相分别采用不同体积比例的二元溶剂混合物水/乙腈(40/60, 35/65, 30/70, v/v)或水/甲醇(20/80, 15/85, 10/90，v/v)。流动相流速设为1.0 mL/min。西罗莫司用乙腈配成1.0 mg/mL作为样品溶液，进样量为20.0 uL，紫外检测波长选择277 nm。

2.3 色谱峰分离度的计算

衡量两个相邻色谱峰分离效果用分离度(resolution,R)来表示，采用下列公式计算分离度：

R=2(tγ-tβ)/(Wβ+Wγ)

(1)

式中tβ和tγ分别为西罗莫司的β峰与γ峰的保留时间(retention time, t)，Wβ与Wγ分别为西罗莫司的β峰与γ峰的峰宽(peak width, W)。如果分离度R≥ 1.5，则表明两个相邻色谱峰完全分离[14]。由于β异构体的含量达90%以上，故将西罗莫司β异构体色谱峰的保留时间、峰宽与分离度作为判断色谱分离效果的依据。建立一种快速且高效分析西罗莫司的色谱方法就是找到一种使西罗莫司β异构体色谱峰的保留时间短，峰宽狭窄且分离度高(R≥ 1.5)的实验条件。

3 实验结果与讨论

3.1 不同体积比例水/乙腈流动相对西罗莫司分离效果的影响

流动相采用不同体积比例的水/乙腈混合物作为流动相，获得西罗莫司的色谱峰见图1。实验获得的色谱图采用Empower 色谙软件处理，从而获得西罗莫司β异构体色谱峰与γ异构体色谱峰的保留时间与与峰宽，再根据式(1)，进一步通过计算获得β峰与γ峰的分离度，结果见表1。实验结果表明：随着流动相中乙腈比例的提高，西罗莫司的β峰与γ峰的保留时间都变短，峰宽都变狭窄，但分离度也相应降低；在乙腈比例提高到70%时，则不能完全分离西罗莫司的β峰与γ峰，结果见表1。当水与乙腈的体积比为40/60或35/65，西罗莫司的β峰与γ峰均能达到完全分离；虽然在乙腈比例为60%，其分离度最高，但保留时间最长。综合西罗莫司色谱峰的保留时间、峰宽与分离度，以水/乙腈混合物作流动相时，水/乙腈(35/65)是最佳条件，西罗莫司β峰的保留时间为20.75 min，峰宽为1.53 min，分离度为2.07。刘英等[9]采用水/乙腈(35/65, v/v)对西罗莫司异构体进行了分离，本文的结果与该文献报道的结果相似。

图1以不同体积比例的水/乙腈作流动相获得的西罗莫司色谱图

Fig1Chromatogramsofsirolimusobtainedusingmobilephaseswithdifferentvolumeratiosofwatertoacetonitrile

表1不同体积比例水/乙腈作流动相对西罗莫司异构体分离效果的影响

Table1Effectofwater/acetonitrilemobilephasesontheseparationofsirolimusisomers

水/乙腈 (v/v)保留时间/min tβ tγ峰宽/min Wβ Wγ 分离度(R) 40/6033.1038.072.35 1.64 2.49 35/6520.7523.571.531.20 2.07 30/70 13.9315.631.341.01 1.44

3.2 不同体积比例水/甲醇流动相对西罗莫司分离效果的影响

流动相采用不同体积比例的水/甲醇混合物，所获得的西罗莫司的色谱峰见图2。按照3.1所述的方法，通过计算获得西罗莫司异构体的分离结果见表2。实验结果表明：随着流动相中甲醇比例的提高，西罗莫司的β峰与γ峰的保留时间都变短，峰宽都变狭窄，但分离度也相应降低；当甲醇比例提高到90%时，则不能完全分离西罗莫司的β峰与γ峰。在水与甲醇的体积比为20/80或15/85时，西罗莫司的β峰与γ峰均能达到完全分离；与水/甲醇(20/80, v/v)相比，水/甲醇(15/85, v/v)的保留时间显著变短。因此，以水/甲醇混合物作流动相时，水/甲醇的适合比例是15/85，西罗莫司的β峰的保留时间为6.94 min，峰宽为0.45 min，分离度为2.77。Ricciutelli等人[8]也采用水/甲醇(20/80, v/v)作流动相完全分离了西罗莫司异构体；与该文献相比，本研究以水/甲醇(15/85, v/v)作流动相所获得的西罗莫司异构体的保留时间更短，峰宽更狭窄。

图2以不同体积比例的水/甲醇作流动相获得的西罗莫司色谱图

Fig2Chromatogramsofsirolimusobtainedusingmobilephaseswithdifferentvolumeratiosofwatertomethanol

表2不同体积比例水/甲醇流动相对西罗莫司异构体分离效果的影响

Table2Effectofwater/methanolmobilephasesontheseparationofsirolimusisomers

水/甲醇 (v/v)保留时间/min tβ tγ峰宽/min Wβ Wγ 分离度(R) 20/8012.4015.690.79 0.81 4.11 15/85 6.948.270.450.51 2.77 10/90 4.795.250.290.35 1.44

无论在西罗莫司洗脱支架的研究开发或质量控制过程中，都需要建立一种快速且分离度高的西罗莫司分析方法。从本研究结果可知，无论在水/乙腈混合物或水/甲醇混合物中，随着有机溶剂比例的增加，西罗莫司的β峰与γ峰的保留时间都变短，峰宽都变狭窄，这是由西罗莫司的结构特征所决定的，西罗莫司的脂溶性极强，其水溶性很差(2.6 μg/mL)[15]，只有加大有机溶剂的比例才能将西罗莫司从反相色谱柱上洗脱下来；但随着有机溶剂比例的增加，西罗莫司的分离度也相应降低。通过调整流动相水/乙腈的比例(35/65)或水/甲醇的比例(15/85)，都能够完全分离西罗莫司的异构体。尤其值得注意的是，与水/乙腈(35/65, v/v)相比，采用水/甲醇(15/85, v/v)作流动相，不仅使西罗莫司β异构体色谱峰的保留时间缩短了约2倍，而且峰宽也变狭窄了2倍以上，其分离度也相应提高(表1、表2)。因此，对于西罗莫司异构体的分离效果，流动相选择水/甲醇(15/85, v/v)显著优于水/乙腈(35/65, v/v)。

4 结论

本研究采用相同的色谱柱与柱温，分别以不同体积比例的二元溶剂混合物水/乙腈或水/甲醇作流动相，用来对比研究不同流动相对西罗莫司异构体分离效果的影响。研究结果表明：在反相色谱柱上，以水/甲醇(15/85)为流动相，可快速且高效地分离西罗莫司异构体，是水/甲醇与水/乙腈流动相体系中的最佳条件。本研究获得的西罗莫司异构体分离的色谱条件可为测试西罗莫司洗脱支架的体外药物释放动力学提供有力的检测方法。