非小细胞肺癌组织中Jdp2、Phf2表达变化及意义

陈蕾，邓燕，潘月影华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉430030

肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率居高不下，严重威胁着人们身心健康[1]。非小细胞肺癌是肺癌中常见的类型之一，占比85%以上[2]，包括鳞癌、腺癌及大细胞癌，其主要临床症状有发热、咳嗽、气促、咯血等。目前非小细胞肺癌的主要治疗方法是手术切除，早期患者治愈率较大，而晚期患者病死率较高。因此，积极寻找非小细胞肺癌发生发展过程中的调控因素，并研究其与疾病发展过程的关系，对非小细胞肺癌的早发现、早治疗有至关重要的作用。Jun二聚化蛋白2(Jdp2)是转录活化因子(AP-1)的一部分，可与原癌基因Fos、活化转录因子(ATF)形成二聚体，具有多种生物学功能[3]，还参与细胞分化、衰老、凋亡等过程[4]。Jdp2在多种肿瘤(胰腺癌、肝癌、骨肉瘤等)细胞中均呈低表达[5]。Phf手指蛋白2(Phf2)是Jmjc家族的一员，其基因位于染色体9q22.31上，由1个结构域和1个功能域组成[6]，Phf2在甲状腺癌、胃癌及结肠癌中均呈低表达。因此，相关研究指出Phf2在肿瘤发展过程中可能充当抑癌基因角色，对肿瘤的进展具有负向调控作用[7]。但Jdp2、Phf2在非小细胞肺癌发生发展中的作用研究较少。本研究分析非小细胞肺癌组织中Jdp2、Phf2表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年3月～2015年6月本院收治的非小细胞肺癌患者86例，男44例，女42例；年龄42～74(60±5)岁，≥60岁44例，<60岁42例；TNM分期为Ⅰ期25例，Ⅱ期30例，Ⅲ期31例；组织分化程度为中低分化57例，高分化29例；组织学分型为鳞状细胞癌(鳞癌)34例，腺癌52例；发生淋巴结转移39例；肿瘤直径<3 cm 46例，≥3 cm 40例。纳入标准：均符合2008版非小细胞肺癌指南诊断标准[8]，均经术后病理检查确诊；均首次诊断为非小细胞肺癌，既往未接受过抗肿瘤治疗；临床病理资料完整并接受随访，且患者及家属签署知情同意书。排除标准：患有其他呼吸系统疾病，如肺炎、支气管炎等；患有其他系统疾病或恶性肿瘤，如胃癌、乳腺癌、结肠癌等；伴免疫系统功能缺陷疾病等。

1.2 取材 以上患者均采用手术治疗，术中切除非小细胞肺癌组织及正常肺组织(距肿瘤边缘>5 cm)，经病理学检查确诊。用中性甲醛固定组织，常规脱水、透明、浸蜡和包埋，切成厚度为2 μm的切片。

1.3 非小细胞肺癌及正常肺组织中Jdp2、Phf2表达检测 采用免疫组化法。将切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，蒸馏水冲洗3次，每次3 min。将切片浸入pH值为6的枸橼酸缓冲液中，加热至100 ℃，3 min后冷却至室温，PBS缓冲液清洗3次，每次3 min。在切片上滴加3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，PBS清洗3次，每次3 min。加入兔抗人Jdp2(山东捷世康生物科技有限公司)和兔抗人Phf2抗体(Abcam公司)，稀释比例均为1∶100，4 ℃储存过夜。第2天用PBS清洗3次，每次3 min，加二抗，30 min后PBS清洗3次。DAB显色3 min，苏木素复染3 min，用自来水冲洗后乙醇梯度水化，晾干后中性树脂封片。结果判定标准[9]：由病理医师用显微镜镜检，Jdp2、Phf2蛋白主要表达于细胞核。染色程度评分：未染色为0分，浅黄色1分，黄色为2分，棕黄色为3分；阳性细胞百分比评分：随机选取每张切片的5个视野(×400)，计算5个视野阳性细胞的平均百分比，<5%为0分，5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%为3分。将以上两项评分相乘<2为阴性，≥2为阳性。

1.4 随访 从患者出院日起，每隔2个月随访1次，以门诊随访或电话随访为主，随访时间为2～60个月，随访至2019年6月或患者死亡，收集患者生存数据。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。率的比较采用χ2检验；相关性分析使用Spearman相关法；用Kaplan-Meier法建立生存曲线，生存率比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌组织与正常肺组织中Jdp2、Phf2表达比较 非小细胞肺癌组织与正常肺组织中Jdp2蛋白阳性表达率分别为48.83%(42/86)、73.25%(63/86)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。非小细胞肺癌组织与正常肺组织中Phf2阳性表达率分别为52.32%(45/86)、79.06%(68/86)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 非小细胞肺癌组织中Jdp2与Phf2表达的相关性 Spearman相关分析结果显示，非小细胞肺癌组织中Jdp2与Phf2表达呈正相关(r=0.672，P<0.05)。

2.3 非小细胞肺癌组织中Jdp2、Phf2表达与患者临床病理特征的关系 非小细胞肺癌组织中Jdp2、Phf2阳性表达与肿瘤TNM分期、组织分化程度有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄及肿瘤直径、病理类型、淋巴结转移无关(P均>0.05)。见表1。

2.4 非小细胞肺癌组织中Jdp2、Phf2表达与患者预后的关系 86例非小细胞肺癌患者均成功随访，随访5年，死亡36例，5年总体生存率为58.1%。Jdp2阳性表达42例，死亡19例，5年生存率为54.8%；Jdp2表达阴性44例，死亡17例，5年生存率为61.4%。二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。Phf2阳性表达45例，死亡22例，5年生存率为51.1%；Phf2表达阴性41例，死亡14例，5年生存率为65.9%。二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 非小细胞肺癌组织中Jdp2、Phf2阳性表达与患者临床病理特征的关系[例(%)]

3 讨论

非小细胞肺癌是肺癌的类型之一，与小细胞癌相比，其转移扩散较慢，易复发、预后较差，患者长期生存率较低。早期非小细胞肺癌的主要治疗手段是手术切除，但往往部分患者发现患病时已发生转移。因此，深入探讨非小细胞肺癌的发病机制，对治疗及预后有至关重要的作用。

Jdp2是由AP-1中Jun蛋白亚基分离出来，可与JunD、JunB、活化转录因子(ATF)等结合，达到抑制癌基因活性的作用[10]。Jdp2主要分为三型，其中Ⅰ型最常见[11]，由163个氨基酸组成，且有1个碱性亮氨酸拉链结构位于其结构中心。有文献报道，Jdp2可以抑制Ras癌基因，从而抑制小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3转化，进而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[12]。本研究非小细胞肺癌组织中Jdp2阳性表达率低于癌旁组织，且Jdp2表达与肿瘤分化程度、临床分期有关，说明Jdp2可能参与非小细胞肺癌的进展。其机制可能为Jdp2与组蛋白乙酰基转移酶结合，抑制组蛋白的乙酰化，抑制肿瘤基因的转录，抑制肿瘤细胞的增殖及分化、停滞其生长周期，进一步抑制了肿瘤细胞的临床分期[13]。当组织中该蛋白表达减少时，使得抑癌作用减弱，间接促进了肿瘤细胞的增殖，使肿瘤组织生长速度加快，恶性程度增加，提高了肿瘤组织的临床分期，且分化程度降低。此外，Jdp2激活肿瘤细胞上皮间质转化过程，促进肿瘤细胞增殖，加快了肿瘤细胞的生长周期，亦增加了肿瘤组织的恶性程度，提高了肿瘤组织的临床分期。这一研究结果与其他研究[5]结果相似。另一方面Jdp2蛋白与羧基末端延伸部分结合，具有促进肿瘤细胞基因转录及分化的功能，使肿瘤分化程度降低，促进肿瘤恶性进展[11]。

KDM7(Jmic)家族包括KDM 7A、KDM 7B、KDM 7C三个成员，KDM 7C又名Phf2，也是最新的KDM7成员，其广泛表达于全身各个组织中，可使赖氨酸末端甲基化，进而调节基因的转录。其中Phf2结构中的结构域将氨基酸甲基化，而功能域将甲基带走。有研究表明，Phf2可以调节H3K9Me2基因去甲基化，促进p53凋亡基因的表达，发挥抑制肿瘤生长的作用[7]，本研究非小细胞肺癌组织中Phf2阳性表达率低于癌旁组织，提示Phf2可能参与非小细胞肺癌的进展。其机制可能为Phf2可使组蛋白赖氨酸末端去甲基化，上调凋亡基因的表达，使得肿瘤细胞凋亡增多、正常组织细胞生成增多，抑制肿瘤细胞的增殖及分化过程，进而抑制肿瘤的恶性进展。而当Phf2表达降低时，其抑癌及促肿瘤细胞凋亡的作用减弱，肿瘤细胞逐渐向周围正常组织转移浸润，加快了肿瘤细胞的生长速度，促进了肿瘤的恶性进展。因此，癌组织中Phf2的阳性表达率低于癌旁组织。本研究结果还显示，非小细胞肺癌组织中的Phf2表达与肿瘤分化程度、肿瘤临床分期有关，机制可能为Phf2亦具有类似抑癌基因的作用，当Phf2表达下调时，其抑制肿瘤细胞的增殖功能减弱，对肿瘤细胞生长起着正向调控的作用，对肿瘤细胞的分化起着负向调控的作用，促进了肿瘤的恶性进展，进一步提高了肿瘤细胞的临床分期，并降低了肿瘤细胞分化程度[14]。Phf2还是AP-1的抑制物，可调节ccna2基因的表达，上调细胞周期蛋白A-2的表达，因此Phf2低表达加快了肿瘤细胞的生长周期，使得肿瘤细胞数量增加，促使肿瘤细胞的临床分期[15,16]。

本研究中Jdp2、Phf2表达阳性的患者5年生存率均高于表达阴性患者。说明二者均可能具有抑制肿瘤发生发展的作用，Jdp2和Phf2表达降低可以反映患者预后不良。研究还显示，Jdp2和Phf2表达呈正相关。原因可能为两者均为AP-1的抑制物，抑制肿瘤细胞增殖、分化，抑制其向周围正常组织侵袭及转移。二者具有协同作用，共同发挥抑制肿瘤细胞生长的作用[17，18]。

综上所述，非小细胞肺癌组织中Jdp2、Phf2表达均降低，与肿瘤分化、临床TNM分期相关。但TNM分期受肿瘤大小及是否有淋巴结转移影响，因此，非小细胞肺癌组织中Jdp2、Phf2低表达状态可能只与另一因素远处转移有关，但本研究未对此进行分析；且也未涉及二者在非小细胞肺癌的发生发展过程中的作用机制。后期需进行大样本的研究对以上问题进行探讨。