环孢素A滴眼液联合维生素A治疗大鼠干眼症的效果及作用机制

姚倩，田蕴霖，周歆，孙连义西安市第四医院，西安710000

干眼症又称结膜干燥症，是指由于泪液质、量或动力学异常引起的泪膜稳定性下降，并伴有眼部炎症、眼部不适、视力受损以及眼组织病变[1]。其主要临床表现为眼部干涩发痒、畏光、畏风，对外界刺激敏感并伴有异物感等，严重者会导致角膜严重病变而影响视力[2]。干眼症作为一种发病率高达30%的眼科疾病，临床主要治疗方法有外科手术和药物治疗，但其病因及发病机制尚不明确，无完全治愈方法。环孢素A滴眼液是由美国食品药品监督管理局批准上市并广泛应用于干眼症治疗的一类药物，临床效果良好、无全身不良反应；但环孢素A滴眼液起效慢，用药周期长。故临床多联合用药解决其起效慢的问题[3，4]。维生素A又称视黄醇，可维持角膜正常形态和功能，防止角膜干燥和退化。缺乏维生素A会引起角膜组织上皮细胞凋亡，导致干眼症[5]。2018年4月～2019年1月,我们探讨环孢素A滴眼液与维生素A联合使用对大鼠干眼症的治疗效果及其潜在的机制，为干眼症的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 健康清洁级SD大鼠50只，体质量(150±20)g，购于南京卡文斯生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXY(苏)2018-0010。氢溴酸东莨菪碱(上海源叶生物有限责任公司产品)；维生素A(东北制药厂集团沈阳第一制药有限公司)；荧光素钠试纸(南京凯基生物科技有限公司)；自杀相关因子(Fas)、自杀相关因子配体(FasL)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、GAPDH抗体，山羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)。光学显微镜、裂隙灯显微镜(上海博览光电仪器)；电泳仪(南京大学仪器厂)；微型垂直电泳槽(上海天能科技有限公司)；凝胶成像仪[辅光精密仪器(上海)有限公司]。

1.2 动物分组及模型制备 将50只SD大鼠随机分为对照组、模型组、环孢素A组、维生素A组、联合用药组，每组10只。用生理盐水稀释氢溴酸东莨菪碱。除对照组外，其他各组制备干眼症模型，于背部皮下注射氢溴酸东莨菪碱0.6 mg/100 μL，4次/d，将大鼠置于通风装置中连续吹风12 h。同时，环孢素A组给予0.05%的环孢素A滴眼，1滴/次，2次/d；维生素A组给予维生素A 200 μg/kg灌胃；联合用药组同时给予环孢素A和维生素A干预，方法同以上两组。各组均干预10 d，造模期间观察大鼠眼部变化。

1.3 泪液分泌量检测 分别于干预第3、7、10天检测各组泪液分泌量。将1 mm×15 mm的泪液试纸置于大鼠下睑外1/3结膜囊内，2 min后取出，迅速测量试纸湿长(精确到0.5 mm)。每只大鼠重复检测3次，计算平均值。

1.4 泪膜破裂时间检测 分别于干预第3、7、10天检测各组泪膜破裂时间。用1滴生理盐水将荧光素钠试纸浸湿，用该试纸尖端轻触大鼠下眼睑内侧并停留片刻，对大鼠辅助瞬目3次使荧光素分布均匀，于裂隙灯钴蓝光下观察角膜出现第1个黑色干燥斑点的时间，每只大鼠重复检测3次，计算平均值。

1.5 角膜损伤评价 方法同1.4。于裂隙灯钴蓝光下观察大鼠角膜染色情况并进行评分，无染色计0分，点状着色计1分，出现块状染色或丝状物计3分，介于两者之间计2分，评分越高角膜损伤越严重。

1.6 角膜与泪腺组织病理变化观察 采用HE染色法。实验结束后，用颈椎脱臼法处死大鼠，取角膜组织于固定液中固定72 h，将组织用梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋后制成厚度约为5 μm的组织切片，切片透明水化，HE染色、封片，于显微镜下拍照，观察组织病理变化。

1.7 角膜组织中Fas、FasL、Bcl-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。取大鼠角膜组织，加入裂解液和蛋白酶抑制剂于4 ℃匀浆继续裂解30 min，12 000 r/min离心5 min，提取总蛋白。BCA蛋白定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对PVDF膜封闭2 h，以1∶1 000比例稀释后的GAPDH、Fas、FasL、Bcl-2一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后室温孵育二抗1.5 h，将PVDF膜浸入发光液，曝光并拍照，用Image J软件计算蛋白条带的灰度值。目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度比值即为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组泪液分泌量比较 干预第3、7、10天，与对照组比较，模型组泪液分泌量少(P均<0.05)，且随时间呈逐渐减少趋势；与模型组比较，环孢素A组、联合用药组泪液分泌量多(P均<0.05)，联合用药组泪液分泌量最多(P均<0.05)。见表1。

表1 各组泪液分泌量比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与环孢素A组比较，cP<0.05；与维生素A组比较，dP<0.05。

2.2 各组泪膜破裂时间比较 干预第3、7、10天，与对照组比较，模型组泪膜破裂时间短(P<0.05)；与模型组比较，环孢素A组、联合用药组泪膜破裂时间长(P均<0.05)，联合用药组泪膜破裂时间最长(P均<0.05)。见表2。

表2 各组泪膜破裂时间比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与环孢素A组比较，cP<0.05；与维生素A组比较，dP<0.05。

2.3 各组角膜损伤程度比较 干预第3、7、10天，与对照组比较，模型组荧光素钠染色评分高(P均<0.05)；与模型组比较，环孢素A组、联合用药组荧光素钠染色评分低(P均<0.05)，联合用药组荧光素钠染色评分最低(P均<0.05)。见表3。

2.4 各组角膜组织病理变化比较 对照组角膜组织细胞正常，上皮层宽厚，基质层细胞排列紧密，无明显病理特征；模型组角膜组织上皮层显著变薄，基质层排列疏松，有毛细血管新生等严重病理反应；环孢素A组角膜组织较模型组变宽，基质细胞排列仍然疏松，毛细血管新生显著减少；维生素A组角膜组织结构与模型组相比无明显差异；与环孢素A组比较，联合用药组角膜组织病理损伤亦得到明显改善。

表3 各组荧光素钠染色评分比较(分，

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与环孢素A组比较，cP<0.05；与维生素A组比较，dP<0.05。

2.5 各组角膜组织中Fas、FasL、Bcl-2蛋白表达比较 与对照组比较，模型组角膜组织Fas、FasL蛋白相对表达量高(P均<0.05)，Bcl-2蛋白相对表达量低(P均<0.05)；与模型组比较，环孢素A组、联合用药组Fas、FasL蛋白相对表达量低(P均<0.05)，Bcl-2蛋白相对表达量高(P均<0.05)，联合用药组Fas、FasL蛋白相对表达量最低(P均<0.05)，Bcl-2蛋白相对表达量最高(P均<0.05)。见表4。

表4 各组角膜组织中Fas、FasL、Bcl-2蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与环孢素A组比较，cP<0.05；与维生素A组比较，dP<0.05。

3 讨论

干眼症又称结膜干燥综合征，多发于中老年人，其发病机制复杂且受多种因素影响。干眼症具体发病机制尚不明确，但有研究表明，其发病可能与眼部炎症、性激素失衡、神经机能障碍、细胞凋亡等有关[6～8]。临床主要通过外科手术或药物治疗来恢复泪液和黏液的分泌，改善角膜组织病变，但都不能治愈。本研究用大鼠皮下注射氢溴酸东莨菪碱抑制泪液分泌，诱导大鼠干眼症模型[9]，观察环孢素A联合维生素A对大鼠干眼症的影响，旨在为干眼症的临床治疗提供新的思路。

环孢素A是一种新型的强效免疫抑制剂，通过抑制淋巴细胞浸润，减少泪腺炎症反应，抑制泪腺组织瘢痕化，增加泪液分泌，预防翼状胬肉术后复发等，能够有效提高患者泪液分泌量、延长泪膜破裂时间、缓解角膜损伤，达到治疗干眼症的目的[10]，但其对于中重度患者起效较慢，且具体作用机制尚不明确[11]。维生素A作为维持人体上皮组织正常代谢的主要营养素，能够有效预防眼角膜的损伤及退化。有研究表明，缺乏维生素A会增加角膜炎、干眼病、夜盲症等眼科疾病，维生素A缺会导致干眼病角膜组织上皮细胞的凋亡[12,13]，所以，本文探究了环孢素A滴眼液和维生素A联合使用是否能够提高环孢素A对干眼症的治疗效果。结果表明，相比于环孢素A单独治疗组，环孢素A滴眼液联合维生素A组干眼症大鼠泪液分泌量显著增加，泪膜破裂时间显著延长。病理检测结果显示，环孢素A滴眼液联合维生素A组大鼠角膜组织病理损伤缓解，说明环孢素A滴眼液联合维生素A能够提高环孢素A对大鼠干眼症的治疗效果。

由于干眼症的发病机制尚不明确，这为干眼症的临床治疗带来困难；但可以确定的是干眼症的病理过程与眼角膜上皮细胞的凋亡有关。研究表明，眼组织细胞凋亡导致干眼症患者泪腺和结膜环状细胞损伤，引起角膜上皮结膜化或鳞状化，并且细胞凋亡亦会引起炎症细胞和淋巴细胞分泌炎症因子分泌异常，影响调控泪液分泌的神经的反射，进而降低神经系统对泪腺的神经支配，加重泪腺腺泡的萎缩。所以，调控细胞凋亡是治疗干眼症的重要手段。Fas及其配体FasL是表面膜蛋白，与细胞凋亡密切相关的[14]，Fas与FasL二者结合后，能够引起Fas的交联，并将信号传递到细胞内，诱导细胞凋亡[15,16]，而干眼症患者眼部组织细胞损伤的重要原因之一是眼部细胞凋亡。所以本研究探究了环孢素A联合维生素A对大鼠角膜组织中Fas、FasL蛋白表达的影响，并且发现环孢素A滴眼液联合维生素A能够显著降低干眼症大鼠角膜组织中Fas、FasL蛋白表达，作用强于环孢素A单独给药。Bcl-2是与细胞凋亡密切相关的癌基因，具有抑制细胞凋亡的作用[17]。正常细胞中Bcl-2高表达，本研究发现，模型组角膜组织中Bcl-2蛋白低表达，环孢素A滴眼液能够显著提高其角膜组织中Bcl-2蛋白表达，环孢素A滴眼液与维生素A联合治疗后Bcl-2蛋白表达升高，且联合用药作用强于环孢素A单独给药。说明环孢素A滴眼液联合维生素A能够缓解角膜细胞凋亡。

综上所述，环孢素A滴眼液联合维生素A治疗大鼠干眼症效果优于环孢素A单独给药，其作用机制可能与降低Fas、FasL表达，提高Bcl-2表达，从而抑制角膜组织细胞凋亡有关。但其具体机制还需进一步研究。