重复经颅磁刺激对AD小鼠脑组织中Aβ1～42水平的影响及机制

陈学云，巴方中国医科大学附属盛京医院，沈阳110000

阿尔兹海默病(AD)是一种进行性认知功能障碍疾病，其最典型的病理特征为脑组织内β样淀粉蛋白(Aβ)沉积、Tau蛋白过度磷酸化，进而导致神经纤维缠结，脑细胞损伤。在正常脑组织中，细胞可通过激活自噬清除异常沉积的Aβ1～42，从而保护细胞。但AD脑组织中细胞自噬异常，导致Aβ1～42清除量减少；恢复自噬则可在一定程度上减轻疾病程度。在线粒体自噬过程中，PTEN诱导激酶1(PINK1)/Parkin通路发挥主要作用；但在AD发病时，PINK1/Parkin通路被抑制[1]。重复经颅磁刺激(rTMS)是一种非侵入性、无痛的人脑刺激手段，可在短时间内使神经元活动的改变发生叠加效应，从而使得刺激效果延长几分钟甚至几小时，反复使用rTMS可使刺激效果达数周或数月。目前rTMS已被临床用于治疗AD[2]，但rTMS治疗AD的具体分子机制尚未完全清楚。2018年12月～2019年12月，本研究观察rTMS对AD小鼠脑组织中Aβ1～42水平的影响及作用机制，以丰富rTMS治疗AD的理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 清洁级C57BL/6雄性小鼠24只，8周龄，体质量18～20 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，使用普通饲料喂养，自由饮食。Aβ1～42购自吉尔生化(上海)有限公司，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，Super M-MLV 反转录酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix购自北京百泰克生物技术有限公司，SYBR Green、苏木精、山羊血清、DAB显色液购自北京索莱宝科技有限公司，Aβ1～42ELISA检测试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司，HRP标记山羊抗兔IgG购自赛默飞世尔科技有限公司，抗PINK1抗体购自武汉三鹰生物科技有限公司，其余抗体、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒等均购自沈阳万类生物科技有限公司。CCY-Ⅰ型磁场刺激仪购自武汉依瑞德医疗设备新技术有限公司，荧光定量PCR仪购自柏业贸易有限公司，电泳仪、转移槽等购自北京六一生物科技有限公司。其余常规试剂均为分析纯。

1.2 动物分组及AD模型构建 将小鼠随机分为假手术组、AD组、低频rTMS组、高频rTMS组，每组6只。各组均用50 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉后，将其头部水平固定于立体定位仪上，沿矢状缝剪开头顶部皮肤，以人字缝和矢状缝交点为原点，参照《小鼠脑立体定位图谱》，于前囟后0.2 mm、中缝左右1 mm、颅骨硬脑膜平面向下2.4 mm处颅骨钻孔，以微量注射器自脑表面垂直进针，假手术组注射无菌生理盐水3 μL，其余各组注射1 μg/μL的Aβ1～42溶液3 μL。注射完毕，留针10 min后缓慢退针。缝合皮肤，将小鼠放回笼中，小鼠苏醒后自由活动，进食摄水。

1.3 rTMS治疗 造模成功后，低频rTMS组、高频rTMS组分别使用1、10 Hz的rTMS进行治疗。方法：制备圆柱形模型，小鼠钻入模型后，头部露出于一端，将小鼠固定于模型内；磁刺激线圈正对小鼠头部，磁头横轴平行于小鼠两耳连线，线圈中心位于前囟上方。先进行10次rTMS，每次50个脉冲，每次刺激间隔20 s。10次刺激完成后休息2 min，进行第2轮rTMS，操作方法与第1轮相同，共刺激2轮。每天治疗1次，连续治疗2周。末次治疗后1 d腹腔注射150 mg/kg戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，取其脑组织固定于10%甲醛溶液中进行后续实验。

1.4 脑组织中Aβ1～42检测 采用ELISA法。取小鼠脑组织使用预冷的PBS清洗去除血液，将其切成小块使用裂解液磨成匀浆，超声处理至澄清，将制备好的匀浆10 000 g离心5 min，弃沉淀取上清。使用ELISA法检测上清液中Aβ1～42水平。

1.5 脑组织中PINK1、Parkin mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。用裂解液提取脑组中总RNA，紫外分光光度计NanoDrop 2000测定各样本中RNA的浓度。将RNA样本进行反转录以得到对应的cDNA。实时荧光定量分析，反应体系：cDNA模板1 mL、PINK1或Parkin上下游引物(10 μmol)各0.5 μL、SYBR GREEN mastermix 10 μL、用ddH2O补足至20 μL；反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s共40个循环，72 ℃ 150 s，40 ℃ 90 s。溶解曲线测定：60 ℃升温至94 ℃，每秒升温1 ℃，25 ℃ 1～2 min。用2-ΔΔCt法计算PINK1、Parkin mRNA相对表达量。PINK1上游引物序列为5′-TCTCAAGTCCGACAACATCCT-3′，下游引物序列为5′-TTGCCACCACGCTCTACAC-3′；Parkin上游引物序列为5′-GACAAGGACACGTCGGTAG-3′，下游引物序列为5′-TAGCCAAGTTGAGCATCG-3′；β-actin上游引物序列为5′-CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT-3′，下游引物序列为5′-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.6 脑组织中PINK1、Parkin及自噬标志蛋白(LC3Ⅰ、Ⅱ及p62、Beclin-1)表达检测 采用Western blotting法。取小鼠一侧脑组织，经裂解制备匀浆抽提蛋白质，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。取总蛋白量相同的各组样本进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转印至PVDF膜；用TBST配置5%脱脂奶粉封闭PVDF膜，用一抗(抗LC3Ⅰ、Ⅱ抗体、抗p62抗体、抗Beclin-1抗体，1∶500)4 ℃孵育过夜。一抗孵育结束后取出PVDF膜，用TBST清洗，用羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)37 ℃孵育45 min，二抗孵育后取出PVDF膜，使用TBST清洗，滴加ECL化学发光试剂，暗室内进行曝光。将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带。β-actin作为内参。目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/β-actin灰度值。实验重复3次取平均值。

2 结果

2.1 rTMS对AD小鼠脑组织中Aβ1～42水平的影响 假手术组、AD组、低频rTMS组、高频rTMS组脑组织中Aβ1～42水平分别为(623.66±137.13)、(2 476.33±614.80)、(1 669.65±372.70)、(1 140.05±246.15)ng/g。与假手术组比较，AD组脑组织中Aβ1～42水平高(P<0.05)；与AD组比较，低、高频rTMS组脑组织中Aβ1～42水平低(P均<0.05)；与低频rTMS组比较，高频rTMS组脑组织中Aβ1～42水平低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 rTMS对AD小鼠脑组织中PINK1/Parkin通路的影响 与假手术组比较，AD组PINK1、Parkin mRNA、蛋白相对表达量低(P均<0.05)；与AD组比较，低、高频rTMS组PINK1、Parkin mRNA、蛋白相对表达量高(P均<0.05)；且高频rTMS组PINK1、Parkin mRNA、蛋白相对表达量高于低频rTMS组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组脑组织中PINK1、Parkin mRNA及蛋白相对表达量比较

2.3 rTMS对AD小鼠线粒体自噬的影响 与假手术组比较，AD组p62蛋白相对表达量高、Beclin-1蛋白相对表达量、LC3Ⅱ/Ⅰ低(P均<0.05)；与AD组比较，低、高频rTMS组p62蛋白相对表达量低，Beclin-1蛋白相对表达量、LC3Ⅱ/Ⅰ高(P均<0.05)，且高频rTMS组以上指标变化更明显(P均<0.05)。见表2。

表2 各组脑组织中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、Beclin-1蛋白相对表达量比较

3 讨论

统计数据表明，在全球范围内超过4 500万人受AD的影响，且随着人口老龄化的加剧导致这一数字不断上升[3]。AD是由多种因素引起、不可逆转的神经退行性疾病，发病机制复杂，但其最为明显的病理特征为脑组织内Aβ的细胞外沉积及细胞内磷酸化Tau蛋白形成神经纤维缠结。Aβ的合成异常、降解异常均可导致AD的发病，清除脑内沉积的Aβ是治疗AD的重要策略[4]。脑组织内Aβ的清除主要通过自噬-溶酶体途径、泛素-蛋白酶途径，前者被认为是主要的Aβ降解途径[5]。但在AD晚期，自噬存在障碍，传统的治疗方法是使药物进入到脑内发挥Aβ清除作用，但随之而来的是药物会改变脑内环境，引起神经损害。寻找更为安全有效的Aβ清除方法对提升AD的治疗效果十分必要。

rTMS是一种安全的颅外刺激方法，已被用于多种神经及精神疾病的治疗，如老龄相关认知障碍、急性脑梗死、梗死后偏瘫及AD[6～9]。针对不同疾病，rTMS可通过改变刺激频率、刺激强度等，影响神经元活性、改善脑功能，发挥不同的调节作用[10]。普遍认为，低频(≤1 Hz)rTMS主要产生抑制性电位，高频(>1 Hz)rTMS主要产生兴奋性电位。两种频率的rTMS均可对AD产生治疗作用。研究表明，rTMS可提高AD患者的记忆力、注意力、思维能力等，改善AD患者的认知功能；并且在一定程度上控制患者异常的精神行为，如妄想症、睡眠障碍等[11]。但有关于rTMS作用机制的研究较为少见，目前已有报道低频rTMS可提高大鼠海马区CA1区域特定N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白质的表达，调节神经元的突触可塑性及连接性[12]；高频rTMS可改变老龄鼠海马突触功能可塑性相关基因的表达。虽然已在临床及动物实验研究中明确了rTMS可对AD产生治疗效果，但rTMS治疗AD的具体作用机制仍需补充和完善。

近年来研究表明，线粒体自噬参与细胞内稳态、增殖、衰老等多种细胞进程，与神经退行性疾病、心脏病等疾病的发生发展相关。PINK1/Parkin途径为介导线粒体自噬的重要途径，在帕金森病的研究中受到关注[13]。PINK1主要定位于线粒体内膜上，当线粒体发生损伤时，PINK1由线粒体内膜向外膜转移，在外膜上聚集，并活化胞质中的E3泛素连接酶Parkin，活化的Parkin被p62识别进一步结合LC3等启动线粒体自噬[14]。在AD患者神经元线粒体中Aβ大量聚集，线粒体肿胀、分裂增加，而融合减少，线粒体功能受损[15]。线粒体自噬可通过清除受损的线粒体和Aβ，对于AD有治疗作用，已有研究报道上调Parkin可降低Aβ的含量[16]。可见，在一定程度上提高线粒体自噬水平可以延缓AD的发生发展。

本研究分别使用低频及高频rTMS治疗AD模型小鼠，结果表明rTMS可使AD小鼠脑组织中Aβ1～42水平降低，证明rTMS可促进小鼠脑组织Aβ1～42的清除；rTMS治疗后可上调AD小鼠脑组织中PINK1、Parkin mRNA及蛋白表达，可见rTMS可激活小鼠脑组织PINK1/Parkin通路。rTMS可调控自噬标志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin-1的表达，增强线粒体自噬。以上表明rTMS可对AD产生治疗作用，但高频rTMS对AD小鼠Aβ1～42清除、线粒体自噬的作用更强。在这可能由于不同频率rTMS产生的电位不同。

综上所述，rTMS可通过激活PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬，从而清除AD小鼠脑组织中Aβ1～42。但本研究仍存在不足之处，脑组织存在多种细胞，如各类神经元、小胶质细胞等，rTMS具体作用于何种细胞，需要在体外进行相关实验进一步探究，从而完善rTMS治疗AD的分子机制。