CASC19低表达对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

王晓昆，张伟，周美娟，谢琦廊坊市人民医院，河北廊坊065000

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，其主要的治疗手段包括手术、放疗、化疗，但术后转移率和复发率高[1]。OSCC发病机制尚不完全清楚，在分子水平研究其发病机制，有助于靶向治疗。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的内源性非编码RNA。研究发现，lncRNA可通过调控基因表达或某些信号通路在OSCC发生发展中发挥作用，可作为临床诊断、监测、治疗靶标及癌症标志物[2]。癌症易感候选基因19(CASC19)是新发现的一种lncRNA，位于染色体8q24 区，其在结直肠癌组织中高表达，与肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移有关，敲低CASC19表达可抑制结直肠癌细胞迁移[3]。但CASC19在OSCC组织中的表达及其对OSCC细胞增殖、凋亡的影响尚不清楚。微小RNA(miRNA)在OSCC发生发展、侵袭和转移中也有重要作用[4]。miR-802在OSCC组织中低表达，与肿瘤TNM分期及淋巴结转移相关，通过介导ROS1参与调控OSCC的发生发展[5]。上调miR-802的表达通过抑制MAP2K4表达抑制舌鳞状细胞癌细胞活力和侵袭[6]。然而miR-802在OSCC发生中的作用机制及lncRNA CASC19是否通过miR-802影响OSCC细胞增殖、凋亡尚未可知。2017年12月～2019年5月本研究对此作了探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人口腔角质细胞株NOK及人OSCC细胞株SCC9、HSC3、CAL-27(中国科学院细胞库)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素(美国Gibico公司)；TRIzol、荧光定量PCR试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；双荧光素酶检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；二辛可宁酸(BCA)试剂盒、RIPA蛋白裂解液、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、十二烷基硫酸钠，钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒、四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗人B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)抗体、兔抗人Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、兔抗人细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗体、兔抗人p21抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体和山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(北京博奥森生物科技有限公司)。酶标仪、FACS caliber流式细胞仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 细胞培养 取人口腔角质细胞株NOK和人OSCC细胞株SCC9、HSC3、CAL-27，用含5%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液置于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养。每隔1 d更换1次培养液，待细胞融合至90%时进行消化传代，选取对数生长期细胞进行实验。用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法确定SCC9细胞中CASC19相对表达量最高，miR-802相对表达量最低，选择SCC9细胞作为实验细胞。

1.3 细胞转染与分组 取对数生长期SCC9细胞培养12 h，将CASC19过表达对照质粒(pcDNA)、CASC19过表达质粒(pcDNA-CASC19)、CASC19抑制表达对照质粒(si-NC)、CASC19抑制表达质粒(si-CASC19)、miR-802阴性对照质粒(miR-NC)、miR-802模拟物(miR-802)分别转染至SCC9细胞，记为pcDNA组、pcDNA-CASC19组、si-NC组、si-CASC19组、miR-NC组、miR-802组；将si-CASC19与miR-802抑制剂阴性对照质粒(anti-miR-NC)、miR-802抑制剂(anti-miR-802)共转染至SCC9细胞中，分别记为si-CASC19+anti-miR-NC组、si-CASC19+anti-miR-802组。采用脂质体法进行转染，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明进行操作。以上质粒均转染6 h后换正常培养基进行培养。用RT-qPCR法证实转染成功。

1.4 细胞内CASC19、miR-802表达检测 采用RT-qPCR法。提取细胞总RNA，微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，按照TaKaRa荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，miR-802和CASC19分别以U6和GAPDH为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次。循环条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；60 ℃延伸5 min。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。miR-802正义链为5′-ACACTCCAGCTGGGTCAGTAACAAAGATTC-3′，反义链为5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正义链为5′-CGCTTCGGCACATATAC-3′，反义链为5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；CASC19正义链为5′-CTCAGCATTTGCCATACTACAT-3′，反义链为5′-TTCTAACCCAGGCACTCCAA-3′；GAPDH义链为5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，反义链为5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。

1.5 CASC19对miR-802的靶向调控检测 采用荧光素酶报告基因实验检测。TargetScan数据库显示CASC19 3′UTR区域有miR-802结合位点。构建野生型和突变型CASC19的荧光素酶表达载体WT-CASC19、MUT-CASC19，用LipofectamineTM2000将WT-CASC19、MUT-CASC19分别与miR-NC和miR-802共转染至SCC9细胞中。按照说明书进行操作，检测荧光素酶活性，实验重复3次。

1.6 细胞增殖活性检测 采用MTT法。各组细胞培养24、48、72 h分别加入MTT溶液20 μL，37 ℃下继续孵育4 h后去除上清液，加入DMSO 150 μL，振荡混匀后在酶标仪上检测490 nm波长处的OD值。实验重复3次，每次设3个复孔。

1.7 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。离心收集各组细胞，PBS漂洗2次，按试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度。实验重复3次，每次设3个复孔，凋亡细胞占总细胞数的比例作为细胞凋亡率。

1.8 细胞内Cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。上样，电泳90 min转膜至PVDF膜上，5 %脱脂奶粉封闭90 min后加入一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗室温孵育2 h，显影，定影，用Quantity One凝胶分析软件处理，测各条带吸光度值(OD)，蛋白相对表达量=目的条带OD值/GAPDH条带OD值。实验重复3次。

2 结果

2.1 CASC19、miR-802在OSCC细胞与NOK细胞中的表达比较 与NOK细胞比较，SCC9、HSC3、CAL-27细胞中CASC19相对表达量高(P均<0.05)，miR-802相对表达量低(P均<0.05)；且SCC9细胞中CASC19相对表达较HSC3、CAL-27细胞高(P均<0.05)，miR-802相对表达较HSC3、CAL-27细胞低(P均<0.05)。见表1。

表1 各细胞中CASC19、miR-802表达比较

注：与NOK组比较，*P<0.05。

2.2 转染效率 si-NC组、si-CASC19组CASC19相对表达量分别为1.01±0.09、0.39±0.04，si-CASC19组CASC19相对表达量低于si-NC组(P<0.05)。miR-NC组、miR-802组miR-802相对表达量分别为1.00±0.08、2.45±0.24，miR-802组miR-802相对表达量高于miR-NC组(P<0.05)。可见转染成功。

2.3 CASC19对miR-802的靶向调控作用 TargetScan数据库预测CASC19与miR-802存在结合位点。转染野生型和突变型CASC19基因表达载体WT-CASC19和MUT-CASC19后，与miR-NC组比较，miR-802组WT-CASC19细胞SCC9的荧光素酶活性低(P<0.05)；而两组MUT-CASC19细胞SCC9的荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 miR-NC组、miR-802组SCC9荧光素酶活性比较

注：与miR-NC组比较，*P<0.05。

2.4 CASC19低表达对SCC9细胞内miR-802表达的影响 pcDNA组、pcDNA-CASC19组、si-NC组、si-CASC19组中miR-802相对表达量分别为1.01±0.09、0.46±0.04、1.00±0.08、2.38±0.23。与pcDNA组比较，pcDNA-CASC19组miR-802相对表达量低(P<0.05)；与si-NC组比较，si-CASC19组miR-802相对表达量高。

2.5 CASC19低表达对SCC9细胞增殖、凋亡的影响 细胞培养48、72 h，与si-NC组比较，si-CASC19组OD值低，细胞凋亡率高，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达低，p21、Bax蛋白表达高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3、4。

表3 si-NC组与si-CASC19组细胞增殖活力、细胞凋亡率比较

注：与si-NC组比较，*P<0.05。

表4 si-NC组与si-CASC19组CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

注：与si-NC组比较，*P<0.05。

2.6 miR-802低表达对CASC19作用的影响 与si-NC组比较，si-CASC19组培养48、72 h细胞增殖活力低，细胞凋亡率高，Cyclin D1、Bcl-2蛋白相对表达量低，p21、Bax蛋白相对表达量高(P均<0.05)；与si-CASC19+anti-miR-NC组比较，si-CASC19+anti-miR-802组培养48、72 h细胞增殖活力高，细胞凋亡率低，Cyclin D1、Bcl-2蛋白相对表达量高，p21、Bax蛋白相对表达量低(P均<0.05)。见表5、6。

表5 各组细胞增殖活力、细胞凋亡率比较

注：与si-NC组比较，*P<0.05；与si-CASC19+anti-miR-NC组比较，#P<0.05。

表6 各组CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

注：与si-NC组比较，*P<0.05；与si-CASC19+anti-miR-NC组比较，#P<0.05。

3 讨论

OSCC以手术治疗为主，但有一定风险；传统放化疗会对患者正常组织造成损害。纳米靶向治疗是近年来一种新的治疗技术，在一定程度上可定点定向治疗，提高治疗效果[7]。研究OSCC的发病机制对寻找潜在的治疗靶点有重要意义[8]。多种lncRNA在OSCC组织中异常表达，调控其发生发展过程，影响OSCC的增殖、凋亡、迁移和侵袭，且与患者预后相关[9]。有研究报道CASC19在结直肠癌组织和细胞系中表达上调，CASC19高表达患者预后较差；此外，CASC19过表达促进结直肠癌细胞侵袭、迁移和增殖[10]。Qu等[11]研究发现，CASC19在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达上调，可通过调节miRNA-130b-3p促进非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭。本研究结果发现，在OSCC细胞中CASC19高表达，抑制CASC19表达后OSCC细胞凋亡率升高，细胞活性降低。说明抑制CASC19表达可抑制OSCC细胞增殖，促进其凋亡。这与CASC19在其他癌症中的作用相符。

p21和Cyclin D1是细胞周期调控关键因子，其功能异常与OSCC发生发展密切相关[12]。Bcl-2、Bax是细胞凋亡相关因子，Bcl-2/Bax高低影响细胞凋亡，也是影响OSCC预后的重要指标[13]。本研究中抑制CASC19表达后OSCC细胞中p21、Bax蛋白表达升高，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达降低。进一步证明抑制CASC19表达可抑制OSCC细胞增殖，促进其凋亡。

有研究表明，部分miRNA也在OSCC组织中异常表达，可通过靶基因或下游信号通路影响肿瘤进展[14]。研究发现，食管鳞癌组织中miR-802低表达，与肿瘤组织分化程度、TNM分期、浸润程度及患者预后相关，可作为诊断及评定患者预后的指标[15]。miR-802过表达抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭[16]。miR-802过表达通过下调FoxM1抑制乳腺癌的增殖[17]。本研究结果显示，在OSCC细胞中miR-802低表达，miR-802过表达后OSCC细胞中p21、Bax表达升高，Cyclin D1、Bcl-2表达降低，细胞凋亡率升高，细胞活性降低。说明miR-802过表达可抑制OSCC细胞增殖，促进细胞凋亡。

此外，CASC19靶向调控miR-802，抑制miR-802表达后，CASC19低表达对SCC9细胞增殖抑制和凋亡的促进作用被抑制。提示，CASC19可能通过调控miR-802表达影响OSCC细胞增殖和凋亡。

综上所述，CASC19低表达可抑制OSCC细胞增殖，促进其凋亡；其作用机制可能与靶向调控miR-802表达有关。这将为OSCC的治疗提供新靶点。