COL7A1与PLEC双基因突变致大疱性表皮松解症一例国内首报

于越乾 暴芳芳 刘红 张福仁

山东第一医科大学附属皮肤病医院（山东省皮肤病医院）山东省皮肤病性病防治研究所 山东省医学科学院，济南250022

通信作者：刘红，Email：hongyue2519@hotmail.com

大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa，EB）是由皮肤结构蛋白基因突变导致的机械性大疱性疾病，临床主要表现为机械性脆性皮肤、张力性大疱和糜烂结痂等。迄今为止，已经发现至少18 个基因突变会导致本病发生，单纯型EB 主要致病基因为KRT5、KRT14 和PLEC，交界型EB 由LAMA3、LAMB3、ITGB4 和ITGA6 等 基 因 突 变 致 病，COL7A1 为营养不良型EB 的致病基因［1］。既往认为EB 为单一基因突变所致，但近年国外文献报道了4 例双基因遗传的病例。我们对收集到的1 例EB 家系进行全基因组外显子测序，结果发现，患儿COL7A1 和PLEC 基因突变共存，为双基因突变所致的隐性遗传营养不良型EB（RDEB），在国内为首次报道。

资料与方法

一、临床资料

先证者男，2 岁，因手足部位出现水疱伴皮肤破损2年，于2018年4月30日来山东省皮肤病性病防治研究所就诊。患儿出生后其口唇皮肤即出现破损，左侧拇指出现大疱，后双下肢包括双足相继出现水疱和大疱，皮损渐延及全身，并伴剧烈瘙痒。在当地医院对症治疗（具体不详），疗效不佳，为进一步治疗遂来我院。患者无其他伴发疾病，足月生产，体格及智力发育均正常。患者家族成员2代4人中没有类似病史。患者父母非近亲婚配。

体检：一般情况可。皮肤科检查：头面、躯干、四肢伸侧及手足可见绿豆至核桃大小水疱、糜烂和结痂，四肢关节易受摩擦处尤为严重，尼氏征阴性（图1）。无血疱，双手足指趾甲及口腔黏膜未受累。结合病史及皮损表现，临床拟诊：EB。为进一步明确其临床型别，对患儿进行全基因组外显子测序。本研究经过山东省皮肤病性病防治研究所伦理委员会批准（批件号20181225KYKT014）。

图1 患儿临床照片 躯干（1A）及面部（1B）见绿豆至核桃大小水疱、糜烂，疱液清亮，部分干涸结痂

二、材料和方法

1.DNA 提取：患儿父母签署知情同意书后，抽取家系中先证者及其父母外周血各5 ml。采用基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血基因组DNA。

2.全基因组外显子测序与Sanger测序验证：构建基因组文库，通过探针杂交捕获与EB 相关基因的外显子及相邻内含子区域（50 bp），并进行富集。富集的目的基因片段通过二代高通量测序仪（美国Illumina 公司）进行测序，平均测序深度133.71X，测序数据与UCSC 网站中既往报道的EB相关基因组hg19 参考序列进行比对，并对目标区域的覆盖度和测序质量进行评估，新一代测序由北京信诺佰世医学检验所完成。得到的原始测序结果排除dbSNP151 数据库、千人基因组数据库、HapMap Project数据库等数据库中存在的单核苷酸多态性位点，通过BWA软件对序列进行比对，并优先与已报道的EB相关基因比对。

根据二代测序结果，对筛选的位点进行Sanger测序验证，并在100例健康对照中验证该位点。应用SIFT 和PolyPhen 软件对发现突变的有害性进行预测。

结 果

先证者PLEC 基因第12772 位核苷酸发生G→A 杂合突变（NM_000445.4：c.12772G＞A），为新发突变，导致第4258 位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸（p.Glu4258Lys），先证者母亲携带该突变，父亲不携带此突变，此突变系从母亲遗传获得（图2）。

同时，先证者COL7A1基因携带2个移码突变，27 号外显子第3625 位发生11 个碱基缺失（NM_000094.3：c.3625_3635delTCTGTCCAGAC），74号外显子第6270 位发生新发突变，为1 个碱基缺失（c.6270delT）所致的移码突变，测序结果见图3。先证者父亲同时携带上述2个移码突变，母亲没有检测到COL7A1 基因突变，证实患儿COL7A1 的突变来自父亲。

所有突变都经过反向测序验证，100 例无关健康对照及公共数据库（dbSNP151数据库、千人基因组数据库、HapMap Project数据库）中未发现类似突变。对突变的有害性进行预测，提示以上3个突变均为有害突变，预测有致病性。

讨 论

RDEB由编码Ⅶ型胶原的COL7A1基因突变所致，在不同临床类型的RDEB中，已报道400多个突变位点。Ⅶ型胶原包括中央三螺旋杆状胶原区域以及氨基端和羧基端，是基底膜带锚纤维的主要组成成分。锚纤维是维持表皮和真皮密切连接的重要结构，缺失会导致皮肤脆性增加［2］。COL7A1 定位在3p21.1，内含复杂内含子和118 个外显子［3］。在RDEB患者中，COL7A1突变主要包括错义突变、剪切位点突变、移码突变、碱基缺失及插入和甘氨酸置换。影响同源三聚体装配以及二聚体二硫键形成的相关位点的错义突变较多见，会破坏Ⅶ型胶原的稳定性。最严重的突变可导致提前终止编码，无功能肽链无法组成锚纤维［4］。本例先证者及其父亲在COL7A1携带复合突变，27号外显子c.3625⁃3635del11 以及74 号外显子c.6270delT，造成编码区移码突变，提前终止编码，肽链合成提前终止，产生无功能肽链。姜薇等［5］于2005 年首次报道1 例Hallopeau⁃Siemens 型RDEB 患者携带COL7A1基因c.3625⁃3635del11突变。

图2 先证者及其父母PLEC基因测序结果 患者及其母亲携带PLEC基因c.12772G＞A突变，父亲未携带此突变

除COL7A1 基因突变外，本文患儿同时携带PLEC基因突变。PLEC基因编码网蛋白，该蛋白为相对分子质量500 000 的中间丝结合蛋白，参与细胞骨架组织的连接［6］，并且富集于基底层角质形成细胞，在基底层细胞骨架、半桥粒和基底膜之间起连接作用［7］。PLEC 突变是8%的单纯型EB 患者的致病基础［8］，目前国际上尚未在RDEB 患者中发现PLEC 基因突变。本研究显示，先证者PLEC 的第12772 位核苷酸发生G→A 杂合突变，导致第4258号氨基酸发生谷氨酸到赖氨酸改变，功能预测有害，而该突变此前未见报道。

本文先证者携带COL7A1 与PLEC 基因3 处突变，但无家族史，其父母各携带1 个基因的突变位点，提示携带单基因突变可能不导致EB 的发生，这和Floeth 和Bruckner⁃Tuderman［9］的观点一致，即单个基因突变位点的发现不足以证实某些特殊家系的遗传基础。双基因遗传病指两个基因累积效应所致的遗传病，当两个不同基因突变发生于同一个体时才会表现出疾病临床表现。 Vahidnezhad等［10］通过二代测序对91 例EB 家系进行遗传学分析，明确了68 例家系致病基因及突变位点，仍有25%的患者不能确定致病基因突变。Padalon⁃Brauch等［11］提出双基因遗传可以解释部分EB高度可变的临床表型。

图3 先证者及其父母COL7A1基因测序结果 先证者及其父亲同时携带COL7A1基因的2个突变，母亲该基因未见突变

迄今为止，国内外共有4例发生双基因突变的EB 家系报道，其中3 例为单纯型EB 患者KRT5 和KRT14基因突变共存。Padalon⁃Beauch 等报道1例患泛发性单纯型EB 的2 岁男孩，从患有局限性单纯型EB 的母亲遗传获得突变KRT5 基因p.Ile183Thr，从无临床症状的父亲遗传获得突变KRT14 基因p.Arg388His，患儿出生后即出现严重的水疱，未累及黏膜［11］。Wertheim⁃Tysarowska 等［12］报道1例临床症状相似的病例，先证者从没有临床症状的母亲获得KRT5基因p.Arg471His突变，从患有局限性单纯型EB 的父亲获得KRT14 基因突变p.Met272Thr，先证者出生后全身出现广泛性水疱；Kim 等［13］报道1 例没有家族史的4 岁患儿，分别从母亲和父亲遗传获得KRT5 基因突变Leu155Pro 和KRT14基因突变Met294Thr，Leu155Pro位于角蛋白5 的1A 保守区域，Met294Thr 位于角蛋白14 的2B区域，亲水的极性苏氨酸代替了疏水的非极性蛋氨酸，功能预测皆为有害突变。有趣的是，患儿同母异父的弟弟仅携带KRT5 基因Leu155Pro 突变，但未出现临床症状，证实单个基因突变不会导致角蛋白功能缺失。此外，Floeth 和Bruckner⁃Tuderman［9］报道COL17A1 与LAMB3 双基因突变的患者，父母亲携带单一突变且没有临床症状，患儿同时携带双基因突变，出生即出现皮肤和黏膜受累，结合病理结果，诊断为交界型EB。

双基因间蛋白产物相互作用以及基因座之间的联系是致双基因遗传病的基础。基底膜带结构由不同基因产物共同维持，EB 双基因遗传可能与基因产物相互作用相关。功能实验证实网蛋白和ⅩⅦ型胶原之间结合有助于维持表皮结构稳定［14］。此外，表皮内角蛋白5与角蛋白14交联形成二聚体构成中间丝，网蛋白C端结构域有助于自身与角蛋白的结合，并协同发挥作用以确保与中间丝结合［15］。以上蛋白相关基因的突变，导致无功能蛋白产物，从而导致EB的发生。

本文报道1 例双基因突变导致的RDEB 患儿，患儿父亲携带COL7A1 基因的2 个移码突变，但并未出现临床症状，推测其另1条正常等位基因可以合成足够的mRNA 来满足锚纤维的数量和质量。患儿母亲携带PLEC 基因的一个点突变，网蛋白虽可以合成，但是错义突变影响了氨基酸，从而影响了网蛋白的结构和功能。检索中国知网、维普和万方数据库以及PubMed 数据库（截至2019 年5 月），显示本例为国内报道的首例携带双基因突变的EB病例，其基因检测结果进一步丰富了EB 的突变致病基因位点库，为EB遗传咨询提供了新的依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突