着色性干皮病两例ERCC2和ERCC5基因突变分析

杨舟 徐哲 焦磊 王珊 马琳

国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科100045

通信作者：马琳，Email：bch_maleen@aliyun.com

着色性干皮病（xeroderma pigmentosum，XP）是一组罕见的常染色体隐性遗传病，其发病机制为部分基因突变导致DNA 损伤修复能力受损，从而引发光敏、皮肤损伤、眼部病变、神经损害、恶性肿瘤、发育障碍等。皮肤癌为XP 患者的主要死因，神经退行性疾病是第二大死因［1］。目前报道XP 共有7个互补型（XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG）和1 个变异型（XPV），分别对应8 种基因（XPA、ERCC3、XPC、ERCC2、DDB2、ERCC4、ERCC5、POLH）突变［2］。本研究采用高通量测序对2 例XP患者进行全外显子组测序（whole ⁃ exome sequencing，WES），结合Sanger测序验证，明确其分别为XPD型及XPG型。

资料与方法

一、病历资料

例1 男，3 岁，出生时皮肤外观正常，日晒后面部出现红斑和肿胀，随后皮肤粗糙、干燥，逐渐出现散在的雀斑样病变和色素痣。皮疹夏季加重，以光暴露部位为主。近1年出现步态不稳，行走时易跌倒。体检：面、耳、颈部和双手背可见大量褐色斑点、斑片，间杂色素减退斑，散在疣状丘疹，躯干散发黑褐色斑丘疹（图1）。神经系统检查：步态不稳，易跌倒，四肢肌张力正常，深部腱反射可引出；指鼻试验、闭目难立征、轮替试验均阴性，未见共济失调；语言发育落后，无法表达完整的句子，智力筛查落后于正常同龄儿范围。其余系统检查未见明显异常。眼科检查正常；纯音测听未发现感音性耳聋；头颅磁共振成像检查大致正常，未见脑萎缩、脑室扩张、基底节及大脑皮质钙化等。

例2 男，1 岁5 个月，生后3 个月日晒后面部出现轻度潮红肿胀，后逐渐出现面部褐色斑点。体检：面部散在褐色斑点、斑片，伴少许色素减退性斑（图2）。体检：神经及其他系统未见异常。眼科、听力检查正常。

2例患儿均为第1胎第1产，父母非近亲结婚，无类似疾病家族史。嘱患者防晒、避光，随访2年，2例患儿皮损均较前有所增多，未出现恶性肿瘤。

二、方法

1.标本采集：用乙二胺四乙酸二钾抗凝管收集患儿及其父母外周静脉血3 ml，使用北京天根生化科技有限公司DNA 提取试剂盒提取DNA（总量＞10 μg，50 mg/L）。本研究符合2013年修订的《赫尔辛基宣言》（https://www.wma.net/policies⁃post/wma⁃declaration⁃of⁃helsinki⁃ethical⁃principles⁃for⁃medical⁃research⁃involving⁃human⁃subjects/）的要求，患儿监护人及健康对照同意基因检测并签署知情同意书。

2.基因突变检测：①WES测序，稀释DNA后采用Covaris 超声仪随机分解成小片段DNA（180 ～280 bp），后经探针杂交和外显子区序列捕获，制备文库并质检，在北京康旭医学检验所应用美国Illumina 公司的Hiseq X Ten 测序平台进行测序，应用BWA（v0.7.15）软件将测序read与人类参考基因组对比，应用GATK（v3.6）软件检测单核苷酸变异和插入/缺失突变；②注释分析，使用ANNOVAR 注释软件注释变异在基因和转录本中的位置，基因相关注释涉及RefSeq、Ensembl、UCSC等数据库，利用千人基因组、GnomAD、TOPMED 等数据库注释变异在人群中的频率，使用蛋白损伤分析工具PolyPhen⁃2、SIFT 及Mutation Taster 进行致病性分析，利用OMIM、HGMD、ClinVar 等数据库对疾病进行注释，重点关注着色性干皮病相关基因XPA、ERCC3、XPC、ERCC2、DDB2、ERCC4、ERCC5 及POLH；③Sanger测序验证，针对单基因所需要验证的位点所在外显子/内含子的上下游序列设计引物（表1），对患儿突变位点进行PCR扩增，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s、60 ℃复性30 s、72 ℃延伸45 s、共35个循环，72 ℃延伸5 min。PCR产物纯化后用ABI 3 730测序仪进行Sanger双向测序，获得数据后对结果进行判读，与Ensembl genome browse 90公布的序列比对分析。进一步对患儿父母进行验证，确定突变来源。

图1 例1临床表现 面部（1A）、背部（1B）、颈部（1C）、双手背（1D）散发大量褐色斑点、斑片，伴色素减退斑，散发疣状丘疹 图2 例2面部散发褐色斑点、斑片，伴少许色素减退斑

结 果

例1存在ERCC2基因复合杂合突变，即父源突变c.1805G＞A（p.Gly602Asp）和母源突变c.586C＞T（p.Arg196Ter）（图3），患儿符合XPD 型。例2 存在ERCC5 基因复合杂合突变，即父源突变c.2533+2T＞C 和母源突变c.2453C＞T（p.Ala818Val）（图4），患儿符合XPG 型。例1 的ERCC2 基因突变c.586C＞T导致编码第196号氨基酸Arg的密码子变成终止密码子，为无义突变；例2 的ERCC5 基因突变c.2533+2T＞C为编码区第2 533位核苷酸后11位内含子中第2位核苷酸由T变为C，为剪切变异，经fruitfly 网站（www.fruitfly.org/seq_tools）剪切位点预测工具预测，突变将导致原有的剪切位点散失，很可能无法正常剪切，导致蛋白功能出现异常。以上两个突变既往未见报道，在千人基因组、GnomAD、TOPMED 等健康人群对照数据库中未发现或频率极低，不属于多态性位点。而ERCC2 基因突变c.1805G＞A 和ERCC5 基因突变c.2453C＞T 为已报道的致病性变异，使用SIFT、Polyphen⁃2和MutationTaster 软件对2 个错义突变c.1805G＞A 和c.2453C＞T 进行功能预测，均分别为“有害”、“很可能损害”和“致病性”，显示其可能致病。Mutation Taster 软件对无义突变c.586C＞T 预测为“致病性”，可产生截短蛋白，影响蛋白功能。PolyPhen⁃2软件显示分析c.1805G＞A、c.2453C＞T 及c.586C＞T 突变所在位点均在不同物种间高度保守。

表1 ERCC2和ERCC5基因Sanger测序引物序列

图3 例1着色性干皮病患儿ERCC2基因复合杂合突变测序图 3A：先证者发生错义突变c.1805G＞A（p.Gly602Asp）和无义突变c.586C＞T（p.Arg196Ter）；3B：先证者父亲发生错义突变c.1805G＞A；3C：先证者母亲发生c.586C＞T无义突变 图4 例2着色性干皮病患儿ERCC5基因复合杂合突变测序图 4A：先证者发生（父源）剪切突变c.2533+2T＞C和（母源）错义突变c.2453C＞T（p.Ala818Val）；4B：先证者父亲发生剪切突变c.2533+2T＞C；4C：先证者母亲发生错义突变c.2453C＞T

讨 论

XPA ～XPG型XP是由涉及核苷酸切除修复机制的蛋白基因缺陷引起。NER可修复紫外线、化学试剂、毒性物质及化疗药物等引起的DNA损伤，以及一些因氧化还原过程产生的损伤［3］。不同分型的XP患者临床表现有所差异，不同地域种族XP分型亦有差异。在日本XPA 占较大比例；在美国XPC 占优势，其次为XPD 或XPV；在欧洲XPC 占主要比例，其次为XPV［4］。检索HGMD Pro、PubMed及万方和CNKI 数据库显示，截至2019 年10 月，我国XPA、XPC占优势［4⁃7］，XPV并不少见［5，7⁃8］，而XPD仅报道2 例［5⁃6］，XPG 报道5 例［5⁃7］。本文报道XPD、XPG各1例，其中XPD为我国少见类型。与其他地区人群XPG罕见相比，我国XPG并不少见，且本例患者症状较轻。

XPD（OMIM#278730）由ERCC2 基因突变引起5′⁃3′ATP 依 赖 的DNA 解 链 酶XPD 活 性 降 低 所致［9］。目前已报道100 余种与疾病相关的ERCC2基因突变，其基因型与表型关系复杂，可导致多种症状且严重程度差异很大，如XPD、XPD 合并Cockayne综合征、毛发硫营养障碍、XP合并毛发硫营养障碍或脑-眼-面-骨骼综合征［4，10］。XPD患者常早期发病，临床表现严重（但轻于XPA），伴急性晒伤反应，雀斑样色素沉着明显，皮肤癌发生率较高［10］。XPD 患者多数可出现原发性神经元变性导致的进行性神经系统损害，如进行性步态不稳、肌张力低下、痉挛、癫痫等。这些症状开始于生命早期，亦可较晚出现，特征为髓鞘形成不足或异常、脑萎缩、钙沉积和脑细胞异常［3］。患者神经系统症状不能完全用紫外线损伤修复缺陷解释，还可能涉及核苷酸切除修复蛋白参与活性氧产生的损伤修复［3］。

我国既往仅报道2例XPD患者，均为复合杂合错义突变所致，尚未发现神经系统症状，其中p.Gly47Arg 位于HD1 区，p.Ile595Ser、p.Gly602Asp、p.Arg666Trp 均位于HD2 区（图5A）［5⁃6］。位于HD2区的突变可导致XP、XP 合并Cockayne 综合征、毛发硫营养障碍或XP 合并毛发硫营养障碍表型［4］。本研究中例1 患儿存在错义突变和无义突变的复合杂合突变，其错义突变p.Gly602Asp 位于HD2 区域（图5A），既往报道可引起XP合并Cockayne综合征。另有研究者报道HD2 区中突变Arg683Trp 可导致XP表型及神经系统疾病进展［4］，而Arg683Gln可导致神经系统轻度异常或晚期发作［10］。p.Arg196Ter 为无义突变，产生截短蛋白，且位于4FeS 簇区域（图5A），推测其对酶活性影响较大。位于4FeS 簇区的突变可导致XP 或毛发硫营养障碍表型，其中I199Pfs*52 突变亦可导致XP 表型［11］。本文例1目前已出现大量雀斑样色素沉着、皮肤异色、疣状丘疹的XP皮肤表现，以及神经系统异常如步态不稳、语言及智力发育落后。有研究显示，合并神经退行性疾病的XP 患者更早发生皮肤癌［2］，故该患儿需严格避光防晒，预防皮肤肿瘤发生。XP 患者发生脑肿瘤的风险可增加50 倍，包括髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤、脊髓星形细胞瘤和神经鞘瘤［3］。该患儿目前头部磁共振成像检查虽未见明显异常，仍需密切观察其神经系统症状进展。

XPG（OMIM 278780）是由ERCC5 基因突变引起结构特异性修复核酸内切酶XPG 活性缺陷所致，目前已报道50 余种ERCC5 基因突变与疾病相关。XPG 患者早期发病，伴急性晒伤反应，有明显的雀斑样色素沉着，可合并神经系统异常、Cockayne 综合征或脑-眼-面-骨骼综合征。其表型广泛，可从轻微到极度受累和进行性神经元死亡导致的神经系统异常［12］。虽有报道本型患者于20岁可发生皮肤癌［1］，但英国一项研究提示，XPG 患者皮肤癌的发生可能少于其他XP亚型［4］。

图5 ERCC2和ERCC5蛋白结构及我国XPD和XPG型着色性干皮病患者基因突变位点 5A：ERCC2共5种突变；5B：ERCC5共8种突变。下划线指示本研究中突变

我国既往报道的5 例XPG 患者中，3 例表现为轻度表型，暂未见肿瘤发生［5，7］；1 例无义突变和错义突变（p.Gln233Ter，p.Gly2Trp）患者合并恐惧症、记忆力差及感觉神经性耳聋［13］；1例复合杂合无义突变（p.Gln37Ter，p.Lys392Ter）患者合并智力减退［5］。本研究中例2 表现为轻度症状，存在剪切突变c.2533+2T＞C 和错义突变p.Ala818Val。尽管突变均位于核酸内切酶活性区域（I区）内（图5B），但与无义或移码突变相比，剪切突变和错义突变对蛋白的影响可能相对较小，保留了一些残留功能而导致轻症。既往研究者推测ERCC5基因的蛋白截短突变可导致XPG/Cockayne 综合征，携带至少1 个ERCC5 非截短突变的患者可能具有轻度XPG 表型［14］，本研究结果支持该推测，并显示I区的错义和剪切突变亦可导致轻症表型。但有文献报道两姐弟患者核酸内切酶I 区纯合错义突变p.Leu778Pro导致轻度XP 皮肤表型合并轻微神经异常［15］。本研究中患儿年龄较小，仍需进一步观察是否出现迟发性神经系统症状。

本文提醒临床医生需提高对XP早期临床表现的认识，以期早诊断、早防治。XPG 患者早期临床表现可较为轻微；合并神经系统异常的患者除XPA外，应注意XPD 的可能。由于本病致病基因较多，临床表型复杂，单独应用Sanger 测序费时、费力且费用较高，采用高通量WES 结合Sanger 测序验证的方法可快速、准确、经济地进行基因诊断和分型，进一步指导预后及遗传咨询。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突