非节段型白癜风患者皮损单细胞转录图谱的初步研究

林福全 洪为松 周妙妮 许文 金嵘 许爱娥

杭州市第三人民医院皮肤科310009

通信作者：许爱娥，Email：xuaiehz@msn.com

目前认为，白癜风的发病是皮肤全层细胞群如角质形成细胞、成纤维细胞、免疫细胞等共同作用的结果［1］。既往的白癜风研究基本局限于单纯黑素细胞或者共培养的黑素细胞与角质形成细胞，但这些研究不仅存在异质性，也不能充分反映白癜风皮肤原位水平的状态和相互作用。近年单细胞转录组测序（scRNA⁃Seq）技术迅猛发展，该技术可以为每个细胞创建一个单独的转录组文库，经降维分析将文库聚类到不同的细胞群中，更为直接地区分特定疾病中的关键细胞群及转录谱［2］。

本研究通过单细胞RNA测序对健康人和白癜风患者皮肤组织进行离散亚群鉴定和关键分子标注，通过寻找关键的细胞亚群和空间分布以及关键功能基因来揭示白癜风皮肤中的关键细胞谱系，进而了解不同病期白癜风皮损全层细胞的生理状态。

材料与方法

一、标本收集及分离

2019 年9 月于杭州市第三人民医院皮肤科门诊收集2 例健康人（无免疫性及系统性疾病）正常皮肤和2例非节段型稳定期白癜风患者皮损标本，取材部位均为腰腹部。其中，2 例健康人均为男性，年龄26、38 岁；2 例白癜风患者亦为男性，年龄31、35 岁。本研究获得安徽医科大学伦理委员会批准（20170224），受试者均签署知情同意书。对获得的全层皮肤进行脂肪分离后放入低钙基础培养基中，用胰蛋白酶（美国Thermo Scientific 公司）解离成单个细胞，37 ℃下孵育15 min。用40 μm过滤器过滤解离的细胞悬液，用培养基洗涤，用死细胞去除试剂盒（美国Miltenyi 公司）在scRNA⁃seq测序前去除死细胞。将分选的细胞1 000 g离心3 min，并重悬于含0.04%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中。后续细胞质检、cDNA 片段标记及测序均在杭州联科生物技术有限公司完成。

二、单细胞微流控扩增及高通量检测

将皮肤细胞浓度调整至700 ～1 200 个/μl，将含有barcode信息的凝胶珠与细胞和逆转录及聚合酶的混合物结合，该凝胶珠被位于微流体“双十字”系统中的油表面活性剂液滴包裹，形成油包水凝珠，流到储液器中并被收集，凝胶乳自然溶解释放Barcode 序列，在凝胶体体系中逆转录cDNA 片段，以cDNA 为模板进行PCR 扩增。将所有凝胶乳的PCR 产物混合，构建标准测序文库。最后利用Illumina测序平台的双端测序模式对建好的文库进行高通量测序。

三、基于10×Genomics高通量测序分析

利用10×Genomics 分析软件Cell Ranger 对原始数据进行过滤、比对、定量，鉴定回收细胞，最终得到各细胞的基因表达矩阵。后续采用Seurat 软件进一步对细胞过滤、标准化、亚群分类、各亚群差异表达基因分析及标记基因筛选。

四、统计分析

用Seurat软件R语言模块标识scRNA⁃Seq中转录亚群的标记基因，Wilcoxon 秩和检验进行测试。用richPathway ReactomePA 软件进行GO 和KEGG途径富集分析，独立样本t检验分析基因富集差异，对P 值进行超几何测试和Benjamini⁃Hochberg 校正。用SPSS 20.0 软件对4 个标本细胞亚群比例进行卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、皮肤的单细胞检测及细胞亚群鉴别注释

本研究中，单细胞悬液上样浓度为300 ～700 细胞/μl，上样体积＜10 μl，单样本捕获量设定为3 000个细胞，上样细胞得率为75%～80%，细胞捕获偏离差异系数低于8%。检测数据具有较好的可控性和可靠性。共检测11 000余个细胞，平均每个细胞基因检测数为2 094。根据标记基因的注释，共区分出19种细胞亚群，其中角质形成细胞占85%～92%，4 个标本间角质形成细胞总量占比差异无统计学意义（χ2=1.42，P ＞0.05）。通过注释标记，还发现成纤维细胞、神经及黑素细胞、内皮细胞、组织干细胞以及以树突细胞和T细胞为主的免疫细胞群，两组间树突细胞和T细胞为主的免疫细胞群及内皮细胞构成比差异无统计学意义（均P ＞0.05），组织干细胞亚群在白癜风皮损中构成比显著低于正常皮肤（0.69%比1.34%，χ2= 6.54，P ＜0.05）。见图1，表1。

二、角质形成细胞及成纤维细胞在白癜风皮损细胞亚群中的分布及定位

图1 单细胞亚群分类及分布 簇号0 ～11、17分别代表角质形成细胞亚群0 ～11、12，12代表抗原提呈细胞及T细胞，13代表神经及黑素细胞，14、16分别代表组织干细胞1、2，15 代表内皮细胞，18 代表成纤维细胞。1A：每个点代表1个细胞，不同颜色表示不同样本的细胞；左图为正常皮肤和白癜风皮损所有细胞亚群的叠加，右图基于所有细胞的19个亚群分布。1B、1C：分别表示正常皮肤和白癜风皮损的细胞亚群分类情况；左图为所有细胞分布，右图为不同细胞亚群的数量和分布

白癜风皮损成纤维细胞存在缺失和数量不足，在2 例白癜风皮损标本中均未检测出18 号成纤维细胞，但正常皮肤中成纤维细胞比例分别为0.26%和0.65%（P ＜0.01）。见表1。

角质形成细胞的分布注释和拟时序分化分析显示，白癜风皮损中角质形成细胞亚群5、6、10、12占比均高于正常皮肤（表1），χ2值分别为216.34、284.43、23.38、68.69，均P ＜0.01。而且，上述4种细胞亚群在白癜风皮损中均位于角质形成细胞外围，是成熟分化较为末端的细胞，其中角质形成细胞亚群5 和10 位于下端，6 和12 位于左上端，靠近成纤维细胞，见图1C。

三、不同角质形成细胞亚群的标记基因表达

对不同细胞群体中上调的表达基因进行表达热图汇总，结果见图2A。从不同细胞群体的前10 条标记基因表达热图中可以看出，不同类型的细胞亚群差异表达显著，明亮区域的细胞虽然占比较少，但是明显区别于其他细胞。而且，角质形成细胞与神经及黑素细胞、内皮细胞、免疫细胞等功能和分化来源完全不同。在这些角质形成细胞群中，编号较大的角质形成细胞亚群虽然占比较少，但是其显示的标记基因表达却更显著和独特，图2A中角质形成细胞5、6、9 和10 均有超过20条以上标记基因表达，这些基因不仅数量更多，表达差异也更显著。角质形成细胞亚群5、6、10的热力图见图2B。

四、与白癜风相关的特殊功能分布的角质形成细胞群鉴别与分析

从图3 看出，角质形成细胞亚群5 主要高表达角蛋白15（KRT15）、胞外基质蛋白（POSTN）、胶原蛋白17（COL17）以及S100A2 基因。GO 富集分析显示，相对于其他角质形成细胞亚群，角质形成细胞亚群5细胞黏附及细胞连接功能相关的350余个基因占比高（P ＜0.01），同时KEGG富集分析也显示，细胞骨架黏附及ECM 通路是主要的高表达通路（P ＜0.01）。

表1 正常皮肤及白癜风皮损中数量差别较大的几组细胞亚群的细胞数占样本中细胞总数的比例（%）

图2 标记基因在各个细胞群体的表达差异 2A：对所有细胞亚群的前10条基因进行热力图绘制，图中黄色代表基因表达水平升高，颜色的亮度代表升高的程度，黄亮度最高的区域代表对应细胞亚群中差异显著的特异性标记基因；2B：角质形成细胞亚群5、6、10的热力图

角质形成细胞亚群6 特异性高表达若干个标记基因，包括分泌型卷曲相关蛋白SFRP1、缝隙连接蛋白GJB家族、SOX9、KRT6等，这些基因均与细胞分化功能相关。GO 分析显示，该细胞群差异基因功能主要集中在细胞骨架结构、角质形成细胞分化功能以及细胞外识别传输及转导功能。KEGG富集分析显示，氧化应激通路（如白细胞介素17通路）等应激传导通路是该群细胞主要的特征性信号通路。

图3 角质形成细胞亚群5前10位标记基因表达分布与GO分析和KEGG分析 3A：单基因在单细胞水平细胞亚群中的表达绝对量和丰度；3B：在细胞亚群及总细胞群中的表达分布及表达水平 tSNE，t-分布随机近邻嵌入；3C：差异基因GO富集性散点图，富集率（rich factor）表示位于该GO功能的差异基因个数与总基因数的比值，富集率越大，GO富集程度越高；3D：KEGG富集分析，富集率表示位于该KEGG通路的差异基因数与总基因数的比值，富集率越大，KEGG富集程度越高

角质形成细胞亚群10高表达垂体瘤转化基因1（PTTG1，可抵抗紫外线诱导的细胞凋亡作用并与细胞增殖、细胞转化有关），此外还特异性高表达CENPF（与细胞恶性分化相关）、高迁移率族蛋白B2（HMGB2）、拓扑异构酶2A（TOP2A）、泛素偶联酶E2C（UBE2C）基因。GO 分析显示，其主要与细胞内稳态、染色体以及RNA/DNA 的结合表达功能相关；KEGG 富集分析显示，富集通路主要集中在细胞周期与DNA 修复通路。而且，与其他角质形成细胞亚群相比，角质形成细胞亚群10 显示出HMGB家族基因的集体高表达，如HMGB1/2/3基因差异检验显示，t值分别为156.32、356.68、34.74，均P ＜0.01。

讨 论

本研究中，每个细胞平均检测2 094个基因，与以前的单细胞RNA 序列研究［3］相一致。我们在前期临床研究中发现，白癜风白斑部位角质形成细胞存在易消化、难培养、难传代的特点，白斑表皮片存在韧性不足的问题。单细胞转录数据显示，角质形成细胞通过增殖和分化可以分别构成屏障层、毛囊和皮脂腺，且许多不同基因的丰度在细胞分化过程中波动，从而形成具有独特的转录谱特征的细胞亚群［4］。我们通过建立正常皮肤和白癜风白斑的单细胞转录组图谱，以期为深刻认识和理解白癜风奠定基础。

本研究对皮肤细胞亚群的鉴别和注释参考传统皮肤细胞分类法进行，所得细胞亚群主要包括角质形成细胞、成纤维细胞、神经及黑素细胞、内皮细胞、组织干细胞、以树突细胞和T 细胞为主的免疫细胞群等，其中，白癜风皮损标本未见成熟分化的成纤维细胞群，未成熟分化的干细胞亚群差异在两组间不显著。就白癜风发病机制而言，缺失的这一小部分成纤维细胞是否是发病的关键值得进一步研究。研究者通过观察非皮损部位成纤维细胞特征发现，白癜风患者成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，且α 平滑肌肌动蛋白高表达，胞内活性氧过度积累。此外，细胞体积增大，黏附蛋白增加，与黑素细胞和角质形成细胞一样呈现衰老表型［5］。结合本研究结果，推测白癜风白斑部位的成纤维细胞缺失对皮肤微环境的滋养和修复功能障碍可能是影响白癜风发病的重要环节。本研究中未在白癜风皮损处发现成纤维细胞，也可能与取材方法和检测技术有关。

此外，通过对细胞数量最多的角质形成细胞进行亚群分类及注释，我们发现，在总细胞比例不变的情况下，部分角质形成细胞亚群在白癜风皮损组织中占优势，如角质形成细胞亚群5、6、10、12，这几组细胞亚群不仅在白癜风中数量居多，在t 分布随机邻居嵌入（tSNE）分布图上也远离主角质形成细胞群，且都标记基因，例如角质形成细胞亚群5高表达KRT15、POSTN、COL17 以及S100A2 基因，亚群6 特异高表达SFRP1、GJB家族、SOX9及KRT6基 因，亚 群10 高 表 达PTTG1、CENPF、HMGB2、TOP2A、UBE2C基因。这几群细胞正是由于有独特的表达特征谱，不仅在角质形成细胞分化程度上不同于其他细胞，其功能也与白癜风疾病发生、发展关系密切。角质形成细胞亚群5 与细胞黏附功能最为密切，角质形成细胞亚群6与细胞应激水平相关，角质形成细胞亚群10 与细胞周期和内稳态关系紧密。有研究显示，白癜风患者来源的角质形成细胞具有凋亡倾向，细胞因子分泌异常可能与局部黑素细胞缺失相关［1］。还有研究显示，白癜风患者角质形成细胞钙摄取能力下降，细胞生存时间缩短，衰老标志分子高表达，不能通过共培养维持黑素细胞生长［6］。结合上述研究，推测异常的角质形成细胞在白癜风患者角质形成细胞总数中占比可能不到20%，但是其异常状态与白癜风发病及进展密切相关，例如角质形成细胞亚群6。

本研究表明，角质形成细胞亚群5和10位置相连，表达谱相似并且重叠较多，角质形成细胞亚群10 的HMGB 家族特异性高表达可能和亚群5 的黏附功能密切相关。核蛋白高迁移率族蛋白超家族的生物学功能主要调节DNA复制、转录、重组和修复等，是真核细胞基因调控的动力体现者，它们在染色质的结构与功能及基因表达调控过程中均发挥重要作用。有报道外部刺激如氧化应激和强烈的紫外线照射会引发角质形成细胞释放HMGB1，HMGB1 的升高触发自分泌HMGB1 易位和黑素细胞抗原的释放，抑制Nrf2 和下游抗氧化基因的表达，诱导黑素细胞凋亡，参与促进树突细胞的成熟和活化，从而参与白癜风的病理过程，促使白癜风发病［7⁃8］。此外，白癜风皮损中HMGB1表达较正常皮肤更高，且与疾病活动性相关［9］。此外紫外线及UVB照射均能有效激活表皮细胞HMGB家族的表达。

最新研究显示，除了黑素细胞，白癜风患者的角质形成细胞膜上E钙黏蛋白也存在表达异常，并且E 钙黏蛋白的表达量与白癜风的疾病活动度密切相关［10］。由此可见，E钙黏蛋白在白癜风的发病中具有重要作用，但导致E钙黏蛋白功能异常的诱发因素以及其参与黑素细胞发病的具体作用机制罕见报道。对于这些角质形成细胞亚群的其他基因组表达水平和功能以及和不同细胞间相互作用的方式和关系有待深入探索，对于白癜风皮损单细胞转录组水平的结果也有待进一步验证和挖掘。本研究的样本量较小，只比较了2例白癜风皮损和正常对照皮肤，因此结果比较初步，有一定的局限性。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突