1例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的家系表型及基因突变分析

唐兰艳，周伟杰，罗美玲，向利群，林发全

1广西医科大学第一附属医院检验科，南宁530021；2广西百色市人民医院检验科

凝血因子Ⅶ（FⅦ）是一种维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，由肝脏合成，当血管内皮受损后，组织因子（TF）即被暴露，FⅦ与TF接触后形成TF-FⅦ复合物，后者可直接激活FⅩ和FⅨ，进而生成凝血酶，故FⅦ在外源性凝血途径启动中扮演重要角色。遗传性FⅦ缺陷症是由编码FⅦ基因发生突变而引起的一种罕见出血性疾病［1］，呈常染色体隐性遗传，临床出血症状通常分为大出血者、轻微出血者和无症状者。为了预防或治疗遗传性FⅦ缺陷症患者出血及其并发症，主要使用凝血因子替代物来纠正凝血缺陷，包括新鲜冰冻血浆、凝血酶原复合物（PCC）、血浆源性FⅦ浓缩液以及重组活化FⅦ等［1-3］。研究发现，遗传性FⅦ缺陷症患者的出血症状与FⅦ凝血活性（FⅦ：C）存在异质性，单一杂合子多为无症状者，而纯合子与复合杂合子的出血症状常较为严重［4］。2018年5月—2019年7月，本研究对1例遗传性FⅦ缺陷症家系进行实验室表型及基因突变检测，发现先证者及其父母FⅦ：C均降低，尤以先证者FⅦ：C降低最为显著，先证者妹妹FⅦ：C正常；先证者存在FⅦ基因第8外显子p.Thr241Asn杂合错义突变与FⅦ基因第7内含子c.681+1G>T杂合剪接位点突变，先证者父亲携带p.Thr241Asn杂合错义突变，先证者母亲携带c.681+1G>T杂合剪接位点突变，先证者妹妹为野生型，通过分析提示上述突变与先证者及其父母FⅦ：C降低有关。本研究为临床医师评估该类患者在手术期或手术后的出血风险，提前做好预防性治疗，规避出血事件发生，提供了一些数据支持与参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 先证者，男性，9岁，因行包皮环切术就诊于我院泌尿外科。术前凝血检查发现其凝血酶原时间（PT）明显增高，且能被正常混合血浆完全纠正；国际标准化比值（INR）升高；凝血酶原活动度（PTA）显著降低；活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）及纤维蛋白原（FIB）均正常。凝血因子检测发现其FⅦ：C显著降低，FⅦ抗原含量（FⅦ：Ag）及其他外源性凝血因子（Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ）活性均正常。先证者无自发性皮肤黏膜出血或外伤后出血不止，无肝脏疾病、肺结核和肾炎等病史，未使用抗凝药物，肝功能、肾功能检查结果均正常。术前24 h对先证者予输注600 IU的PCC进行预防性治疗（200 IU/8 h），检测结果显示PT为39.80 s，INR为3.32，PTA为19%。手术过程顺利，出血量约30 mL，无需输血。术后继续输注800 IU的PCC（200 IU/8 h），检测结果显示PT为27.80 s，INR为2.24，PTA为21%，先证者无继发出血，恢复良好。先证者父母为非近亲结婚，先证者有一妹妹，家系成员均无出血及血栓相关疾病史。先证者及其家系成员均已签署知情同意书。

1.2 家系表型分析方法 采集先证者及其家系成员的枸橼酸钠抗凝血各1管，每管2 mL，在IL-ALC TOP700血凝分析仪（美国IL公司）上采用凝固法分别检测PT、INR、PTA、APTT、TT、FIB、因子Ⅱ活性（FⅡ：C）、因子Ⅴ活性（FⅤ：C）、因子Ⅶ活性和因子Ⅹ活性（FⅩ：C）；采集先证者及其家系成员、20名健康人的枸橼酸钠抗凝血各1管，每管2 mL，根据《罕见遗传性出血性疾病诊断与治疗中国专家共识（2021年版）》［5］，PT纠正试验采用患者血浆与20人份健康人混合血浆按照1：1混合，即刻检测该混合血浆PT，然后置于37℃水浴1、2 h分别检测PT。采集先证者及其家系成员的不抗凝全血各1管，每管5 mL，使用酶联免疫吸附法（中国江苏晶美公司）检测FⅦ：Ag；采集先证者及其家系成员的不抗凝全血各1管，每管5 mL，在HITACHI 7600-020型生化分析仪（日本日立公司）上采用酶法分别检测肝功能与肾功能。所有试剂均为配套试剂，操作步骤均按照仪器的标准操作规程进行。

1.3 FⅦ基因突变分析方法 采集先证者及其家系成员的EDTA抗凝血各1管，每管2 mL，使用吸附柱法提取人类基因组DNA。在illumina HiSeq2500和ABI 3730 DNA分析仪上分别进行高通量测序及Sanger测序，由北京金准基因科技有限公司完成检测。高通量测序发现FⅦ基因外显子及剪切位点突变后，采用Sanger测序验证突变位点，应用Primer Premier 3.0软件设计引物，FⅦ基因第7外显子及侧翼的正向引物：5´-TCCCTCACAAATCTCTGCATC-3´，反向引物：5´-GTGGGCTTGGGGCTGAC-3´；FⅦ基因第8外显子及侧翼的正向引物：5´-AGAGCAC‑GTCTCGGCTAGAG-3´，反向引物：5´-AGCCCCT‑GAGACACTTGAGA-3´，使用Chromas Lite 2.01软件比对测序结果与NCBI基因库公布的参考序列（NG_009262.1），确定突变位点。应用ClustalX2.1软件（http：//www.clustal.org/clustal2/）比对来自NCBI数据库10个物种（包括人类、红原鸡、热带爪蟾、黑猩猩、猕猴、家犬、小家鼠、褐家鼠、牛和斑马鱼）FⅦ基因的氨基酸序列。应用FATHMM（http：//fathmm.biocompute.org.uk/）、Mutation Assessor（http：//mutationassessor.org/r3/）、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVE‑AN（http：//provean.jcvi.org/seq_submit.php）和SIFT（http：//provean.jcvi.org/protein_batch_submit.php？species=human）五个生物信息学软件分别预测突变氨基酸是否有害或对FⅦ蛋白质功能有无影响。将NCBI数据库公布的FⅦ蛋白参考序列（NP_000122.1）作为模板，应用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）构建野生型与突变型FⅦ蛋白模型，并使用PyMOL2.2.0软件（https：//pymol.org/2/）分析野生型与突变型FⅦ蛋白构象。

2 结果

2.1 家系表型分析结果 先证者PT显著增高，为49.00 s；INR明显增高，为3.86；PT延长能被健康人混合血浆完全纠正；PTA明显降低，为10%；FⅦ：C显著下降，为0.60%；其余指标均正常。先证者父亲FⅦ：C轻度降低，为42.70%；其余指标均正常。先证者母亲FⅦ：C约降至正常值的一半，为29.70%；其余指标均正常。先证者妹妹各项指标均正常。详见表1。

表1 家系部分凝血功能及凝血因子活性结果

2.2 基因突变分析结果 先证者及其父亲FⅦ基因第8外显子均发生c.722C>A杂合错义突变（图1A），即ACC→AAC，导致第241位苏氨酸（Thr）突变为天冬酰胺（Asn）；先证者母亲及先证者妹妹为野生型（图1B）。先证者及其母亲FⅦ基因第7内含子均发生c.681+1G>T杂合剪接位点突变（图1C）；先证者父亲及先证者妹妹为野生型（图1D）。应用ClustalX2.1软件比对来自NCBI数据库10个物种之间FⅦ基因的氨基酸序列，结果显示Thr241残基保守性较低（图2）。五个生物信息学软件分析结果均提示p.Thr241Asn突变为有害突变或影响蛋白质功能。FⅦ蛋白建模结果显示，发生p.Thr241Asn突变后，Thr241与Val249残基形成的两个氢键和Asn241与Val249残基形成的氢键相似。Thr241残基位于FⅦ蛋白的催化功能区，当发生p.Thr241Asn突变后，Asn241引起Gly177～Pro189肽链出现明显的折叠与空间构象改变。由于c.681+1G>T剪接位点突变会导致10个氨基酸残基（Val218～Gln227）缺失［6］，与野生型FⅦ蛋白比较，c.681+1G>T突变型FⅦ蛋白Ser207～Gln227肽链缩短为Ser207～Lys217肽链，导致Cys219与Cys224之间形成的链內二硫键丢失，引起Ser207～Lys217肽链、Gly156～Glu192肽链发生较大的折叠与空间构象改变。与野生型FⅦ蛋白比较，p.Thr241Asn&c.681+1G>T复合杂合突变型FⅦ蛋白Ser207～Lys217肽链（图3A）和Gly156～Glu192肽链（图3B）均发生明显的空间构象变化，且该复合杂合突变导致Gly156～Glu192肽链构象变化与单独c.681+1G>T突变引起该段肽链改变存在一些空间差异。

图1 FⅦ基因第8外显子及第7内含子测序结果

图2 FⅦ基因Thr241残基保守性分析结果

图3 野生型与p.Thr241Asn&c.681+1G>T复合杂合突变型FⅦ蛋白建模结果

3 讨论

FⅦ的编码基因为FⅦ，位于第13号染色体长臂3区4带（13q34），大约距离FⅩ基因上游2.8 kb，由9个外显子和8个内含子组成［7］。FⅦmRNA的选择性剪接可生成含38或60个氨基酸的前导序列，分别由外显子1和2编码，而肝脏中90%的FⅦ转录本不存在外显子2，故前导序列多数情况下为38个氨基酸。外显子3和4编码部分前肽及γ-羧基谷氨酸区，外显子5和6编码两个表皮生长因子样（EGF-1和EGF-2）区，外显子7、8和9编码具有催化作用的丝氨酸蛋白酶区（即催化区），因此成熟的FⅦ由406个氨基酸组成，具有上述4个蛋白结构域［8］。遗传性FⅦ缺陷症由FⅦ突变引起，在罕见遗传性出血性疾病中最为常见，其患病率约为1/500 000［4-5，9］，而在一些近亲结婚很频繁的地区或部落，该病患病率可能更高［8，10］。根据FⅦ：C和FⅦ：Ag的质量缺陷不同，遗传性FⅦ缺陷症分为两种类型［11］：Ⅰ型为数量缺陷，即FⅦ凝血活性（FⅦ：C）和FⅦ抗原含量（FⅦ：Ag）两者均降低；Ⅱ型为质量缺陷，即FⅦ：C下降，而FⅦ：Ag正常或接近正常（提示FⅦ蛋白存在功能缺陷）。根据临床表现不同，遗传性FⅦ缺陷症患者分为三类［12］：大出血者，即至少有一种脑出血、胃肠道出血或关节出血的患者；轻微出血者，即无大出血史，但出现月经增多、脐带残端出血、齿龈出血、鼻出血、皮肤黏膜出血或皮肤瘀斑等的患者；无症状者，即证实是遗传性FⅦ缺陷症而无自发轻微或大出血的患者。

遗传性FⅦ缺陷症的出血症状可表现为从无症状到危及生命，严重程度存在明显的个体差异。MARIANI等［13］发现，515例遗传性FⅦ缺陷症患者中39%为无症状者，61%有出血症状，其中常见症状是鼻衄（61%）、皮肤瘀斑（46%）、齿龈出血（30%）、术后出血（25%）和经血过多（在有症状的女性患者中占57.5%）。此外，较常见的出血症状为肌肉血肿、关节出血、血尿、消化道出血和脑出血［5］。通常情况下，FⅦ：C<70%者存在FⅦ缺陷，FⅦ：C<30%者有出血症状［11］。国际血栓止血学会标准委员会根据FⅦ：C水平不同，将遗传性FⅦ缺陷症分为三类［14］：严重缺陷，即FⅦ：C<10%（患者自发性大出血风险最高）；中度缺陷，即10%～20%（患者具有轻微自发性或触发性出血风险）；轻度缺陷，即20%～50%（患者通常表现为无症状）。尽管如此，FⅦ：C<1%的FⅦ缺陷症患者也可表现为无出血倾向［15］，说明FⅦ：C水平与临床出血表型存在异质性，两者之间相关性弱［15-17］。由于再生障碍性贫血、急性髓性或淋巴细胞白血病、骨髓纤维化和造血干细胞移植等患者可发生获得性FⅦ缺陷［18-20］，或者患者存在维生素K缺陷、罕见抗凝物等［15］，都会造成FⅦ：C水平降低，因此临床医师在诊断遗传性FⅦ缺陷症时，需与上述因素进行鉴别。本研究中先证者为无症状者，PT明显延长，INR明显增高，PTA明显降低，FⅦ：C显著降低，而PT纠正试验、APTT、TT、FIB、FⅦ：Ag、血小板计数和肝功能均正常，与遗传性FⅦ缺陷症的筛选试验结果相符［5］。临床医师综合评估了先证者在围手术期的出血风险，认为其发生出血事件的概率较大，故术前及术后均对先证者予输注PCC进行预防性治疗，手术过程顺利，无需输血，术后也无继发出血，恢复良好。另外，先证者父亲及母亲FⅦ：C均轻度降低，但临床上都无出血症状，其他检测结果均正常，说明血液状态良好，无需特殊处理。

FⅦ突变将导致遗传性FⅦ缺陷症，目前通用突变数据库（UMD）共收录了FⅦ突变800余种［21］，其中大部分为错义突变，约占78%，其余为剪切位点突变、小缺失、无义突变等，且以第8外显子发生突变居多［7，17］。本研究中先证者及其父亲FⅦ第8外显子均存在c.722C>A杂合错义突变，导致p.Thr241 Asn，先证者母亲及先证者妹妹均为野生型；还发现先证者及其母亲FⅦ第7内含子均发生c.681+1G>T剪接位点突变，先证者父亲及先证者妹妹均为野生型。根据孟德尔遗传学推测p.Thr241Asn突变来自先证者父亲，c.681+1G>T突变来自先证者母亲。对于p.Thr241Asn突变，国内外已报道三个家系共四例遗传性FⅦ缺陷症患者［4，7，22］。本研究中，同源物种氨基酸多序列比对分析提示Thr241残基保守性不高，我们得知红原鸡、小家鼠、褐家鼠及斑马鱼在第241位置的氨基酸分别为Ser、Val、Val和Val，并非Thr，由此推测单独发生p.Thr241Asn突变对FⅦ蛋白的分泌及稳定性影响较小［7］，该推论在先证者及其父亲FⅦ：Ag含量正常中得到了证实。通过五个生物信息学软件分析我们发现，p.Thr241Asn的预测结果较为一致，均显示该错义突变可能为有害突变或影响FⅦ蛋白功能，说明p.Thr241Asn为致病性突变。FⅦ蛋白建模结果显示，Thr241残基位于丝氨酸蛋白酶区（即催化区），处于催化活性中心，发生p.Thr241Asn突变后，由于Thr和Asn均属于极性、中性氨基酸，引起侧链及极性的变化较小，因此野生型Thr241残基、突变型Asn241残基分别与Val249残基形成的氢键相似。将野生型与p.Thr241Asn突变型FⅦ蛋白模型进行比对，我们发现后者Gly177～Pro189肽链发生了明显的折叠以及空间构象的改变，这种改变可能是导致先证者及其父亲FⅦ：C降低的主要原因。c.681+1G>T剪接位点杂合突变首次在一名马来西亚籍遗传性FⅦ缺陷症患者中被报道［7］，该患者具有轻度出血症状，FⅦ：C为45%。CAVALLARI等报道了4例无血缘关系的泰国籍遗传性FⅦ缺陷症患者，其中两例是c.681+1G>T纯合子，临床症状分别为胃肠道、颅内出血；第三例是c.681+1G>T与W424X复合杂合子，有颅内出血史；第四例是c.681+1G>T与C389G复合杂合子，症状为轻度出血［6］，该研究发现c.681+1G>T激活第7外显子一个隐蔽供体剪接位点，导致一个编码缺失10个氨基酸残基（Val218～Gln227）的FⅦ变异体；还发现c.681+1G>T纯合子虽仅分泌极少量具有功能的FⅦ蛋白，却足以启动凝血，推测该FⅦ变异体与其分泌、活化和催化功能是兼容的。本研究通过FⅦ蛋白建模分析发现，c.681+1G>T突变型和p.Thr241Asn&c.681+1G>T复合杂合突变型FⅦ蛋白Ser207～Gln227肽链均缩短为Ser207～Lys217肽链，造成Cys219与Cys224之间形成的链內二硫键丢失，导致Ser207～Lys217肽链、Gly156～Glu192肽链均发生明显的折叠与空间构象改变，但该两种突变型FⅦ蛋白Gly156～Glu192肽链的空间构象改变存在一些差异，可能是导致先证者与其母亲FⅦ：C水平相差较大的根本原因。

总之，先证者及其父母FⅦ：C均降低，尤以先证者FⅦ：C降低最为显著；先证者发生FⅦ基因第8外显子p.Thr241Asn杂合错义突变与FⅦ基因第7内含子c.681+1G>T杂合剪接位点突变，先证者父亲携带p.Thr241Asn杂合错义突变，先证者母亲携带c.681+1G>T杂合剪接位点突变。