宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p的表达变化及其临床意义

崔楠，朱小丹，花仲首，张景宏

本溪市中心医院妇产科，辽宁本溪117000

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大常见女性恶性肿瘤，也是第三大最常见的恶性肿瘤，每年导致265 700人死亡［1-2］。近年来随着宫颈癌筛查手段的提升和乳头瘤病毒的覆盖率扩大，早期诊断率显著提高，但患者晚期生存率仅40%，复发和转移是限制疗效和预后较差的重要因素，因此迫切需要了解宫颈癌内在机制，以发展新的抗癌策略［3］。非编码RNAs是一类不编码蛋白质的RNA，其可通过调节各种基因表达参与肿瘤发生发展［4-5］。同源盒基因D—反义链1（HOXD-AS1）是HOXD基因簇中的一种反义lncRNA，其在胃癌、甲状腺癌等实体肿瘤中呈高表达，作为癌基因参与肿瘤发生发展［6-7］。微小RNA-133a-3p（miR-133a-3p）是一种高度保守的miRNA，其参与调控胃癌和骨肉瘤等实体肿瘤的增殖、侵袭、转移等行为［8］。有研究［9］发现，lncRNA HOXD-AS1可以介导miR-133a-3p调控宫颈癌细胞增殖和凋亡。因此，猜测lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达可能参与宫颈癌癌症进展，然而两者与宫颈癌的关系的研究鲜有报道。2015年1月—2017年12月，我们观察了宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取本溪市中心医院收治的宫颈癌患者92例，年龄38～83（57.68±8.63）岁；≥60岁53例、<60岁39例。纳入标准：①经术后（根治性或姑息性切除）病理检查确诊为宫颈癌；②初次确诊，术前未接受任何内分泌、放化疗者；③临床资料完整者；④患者及家属均知情研究。排除标准：①合并其他部位肿瘤者；②严重心、肝、肾等脏器疾病者；③血液系统疾病者；④全身感染性疾病者；⑤血液系统疾病者；⑥妊娠及哺乳妇女。病理类型：75例鳞癌，17例腺癌；肿瘤直径：≥3 cm 50例，<3 cm 42例；肿瘤分化程度：低分化35例，中高分化57例；国际妇产科联盟（FIGO）分期［10］：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期39例；淋巴结转移33例，无淋巴结转移59例。手术留取宫颈癌及其癌旁（距离癌组织>5 cm）组织各92例份。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 宫颈组织中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p检测方法 取宫颈癌及其癌旁组织标本，剪碎并研磨，TRIzol总RNA抽提试剂盒（无锡百泰克生物技术有限公司，货号：RP2401）提取组织中总RNA，Nano Drop 1000超微量分光光度计和凝胶电泳检测RNA浓度、纯度、完整性。Takara逆转录试剂盒（上海红荣微再生物工程技术有限公司，货号：RR036A）合成cDNA，进行qRT-PCR反应，lncRNA HOXD-AS1上游引物：5´-GGCTCTTCCCTAATGTGT‑GG-3´，下游引物：5´-CTCTGGTTGGGTGACTGGTT-3´；miR-133a-3p上游引物：5´-CGAGCCTTTG‑GTCCCCTTCAAC-3´，下游引物：5´-TCAACTGCTG‑GTGTCGTGGAGTCGGC-3´；反应体系：10μL SYBR GreenⅠMaster、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、2μL DNA模板、8.5μL RNase-Free H2O；反应条件：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、35 s，72℃、30 s，循环40次。分别以GAPDH（上游引物：5´-GGTG‑GTCTCCTCTGACTTCAACA-3´，下游引物：5´-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAAATG-3´）、U6（上游引物：5´-CTTCGGCAGCACATATACT-3´，下游引物：5´-AAAATATGGAACGCTTCACG-3´）作内参校正，2-ΔΔCt法计算组织中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验；正态分布且方差齐的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；相关性分析采用Pearson相关分析法；Kaplan-Meier曲线绘制生存率，组间生存率比较采用Logrank检验；Cox回归分析法分析宫颈癌患者预后不良影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌、癌旁组织中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相对表达量比较 宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相对表达量分别为2.064±0.644、0.947±0.305，癌旁组织分别为1.044±0.275、1.572±0.563，两者比 较，P均<0.05。

2.2 宫颈癌组织中lncRNAHOXD-AS1与miR-133a-3p表达的相关性 宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1与miR-133a-3p表达呈负相关（r=-0.663，P<0.05）。

2.3 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达与宫颈癌临床病理参数的关系 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达与宫颈癌临床病理参数的关系见表1，由表1可知，lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移有关（P均<0.05）。

表1 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达与宫颈癌临床病理参数的关系（±s）

表1 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达与宫颈癌临床病理参数的关系（±s）

临床病理参数年龄≥60岁<60岁病理类型鳞癌腺癌肿瘤直径≥3 cm<3 cm肿瘤分化程度低分化中高分化FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴结转移有 无53 39 75 17 50 42 35 57 53 39 33 59 lncRNA HOXD-AS1 2.104±0.696 2.009±0.570 2.086±0.653 1.966±0.610 2.165±0.688 1.943±0.572 2.228±0.599 1.963±0.655 1.918±0.533 2.271±0.734 2.352±0.693 1.903±0.559 miR-133a-3p 0.935±0.308 0.963±0.303 0.936±0.312 0.984±0.274 0.918±0.301 0.981±0.309 0.869±0.236 0.995±0.333 1.023±0.275 0.839±0.316 0.836±0.258 1.009±0.313

2.4 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达与宫颈癌患者预后的关系 以lncRNA HOXD-AS1、miR-

133a-3p均值将92例宫颈癌患者进行分组，lncRNA HOXD-AS1≥2.064患者（40例）和lncRNA HOXDAS1<2.064患者（52例）术后3年总生存率分别为30.00%（12/40）、67.31%（35/52），两者比较，P<0.05；miR-133a-3p≥0.947患者（45例）和miR-133a-3p<0.947患者（47例）术后3年总生存率分别为68.89%（31/45）、34.04%（16/47），两者比较，P<0.05。

2.5 宫颈癌患者预后不良影响因素Cox回归分析结果 所有患者出院后均通过门诊或电话方式随访，随访2～36个月，中位22个月；死亡47例，存活45例。死亡患者年龄≥60岁35例（74.47%）、鳞癌40例（85.11%）、肿瘤直径≥3 cm 28例（59.57%）、低分化23例（48.94%）、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期25例（53.19%）、淋巴结转移28例（59.57%）、lncRNA HOXD-AS1≥2.064 31例（65.96%）、miR-133a-3p≥0.947 14例（29.79%），存活患者年龄≥60岁18例（40.00%）、鳞癌35例（77.78%）、肿瘤直径≥3 cm 22例（48.89%）、低分化12例（26.67%）、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期14例（31.11%）、淋巴结转移5例（11.11%）、lncRNA HOXD-AS1≥2.064 9 例（20.00%）、miR-133a-3p≥0.947 31例（68.89%），两者年龄≥60岁比例、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期比例、淋巴结 转 移 比 例、lncRNA HOXD-AS1≥2.064比例、miR-133a-3p≥0.947比例比较，P均<0.05。以年龄（≥60岁=1，<60岁=0）、FIGO分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴结转移（有=1，无=0）、lncRNA HOXD-AS1（≥2.064=1，<2.064=0）、miR-133a-3p（≥0.947=1，<0.947=0）为自变量，随访时间为时间变量，预后（死亡=1，存活=0）为因变量，经多因素Cox回归分析，显示FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、lncRNA HOXD-AS1≥2.064为宫颈癌患者预后不良独立风险因素，miR-133a-3p≥0.947为独立保护因素（P<0.05）。详见表2。

表2 宫颈癌患者预后不良影响因素的多因素Cox回归分析结果

3 讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，与人乳头瘤病毒持续感染、性行为、分娩次数、多个性伴侣、多孕多产等有关，主要症状为阴道流血、不正常阴道排液、接触性出血等，但早期常无明显症状，大多患者确诊时已达中晚期。尽管近年来宫颈癌筛查、手术、放疗、化疗取得了重大进展，但晚期和复发宫颈癌患者的治疗效果仍不令人满意。肿瘤的生长依赖一系列促癌基因的激活，阻断这些通路中关键胞内蛋白或膜受体，可发挥抑制肿瘤生长、转移及促进凋亡作用，因此近年来出现了以肿瘤特异性分子靶标为基础的靶向和免疫疗法，虽然显著延长了宫颈癌患者生存时间，但仍未达到最终效果，因此迫切需要进一步深入研究其分子层面，以揭示新的治疗靶点［11］。蛋白编码基因一直是肿瘤研究热点，人体中95%以上的蛋白编码被转录为非编码RNA，在RNA水平就可行驶各自生物学功能，在细胞生长、分化、增殖、上皮间质转化、凋亡等过程发挥重要调控作用。

lncRNA是一类转录本>200个核苷酸的非编码RNA，可通过影响表观遗传、转录和转录后水平来调节基因表达，影响细胞生长、分化、增殖［4］。lncRNA HOXD-AS1位于人染色体2q31.2，进化过程中高度保守，近年研究表明，其参与多种恶性肿瘤进展［12-13］。SUN等［12］研究显示，沉默lncRNA HOXD-AS1可通过丝裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外调节蛋白激酶通路抑制肝癌细胞增殖、细胞周期进程、迁移、侵袭。LI等［13］研究显示，lncRNA HOXD-AS1可通过miR-520c-3p/v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源体轴促进胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭。本研究显示，宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1表达明显高于癌旁组织，且与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移有关，说明lncRNA HOXD-AS1高表达参与了宫颈癌进展。进一步分析显示，lncRNA HOXD-AS1≥2.064患者术后3年总生存率明显降低，术后3年死亡增加1.217倍，说明lncRNA HOXD-AS1可作为宫颈癌患者预后评估生物标志物。Ras/细胞外调节蛋白激酶信号通路在肿瘤恶性转化过程中发挥重要作用，参与肿瘤异常增殖、侵袭、转移［14］。体外沉默裸鼠宫颈癌细胞lncRNA HOXD-AS1发现，宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力和Ras/细胞外调节蛋白激酶的磷酸化明显受抑，提示lncRNA HOXD-AS1可通过Ras/细胞外调节蛋白激酶信号通路促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭［15］。CHI等［16］也发现，对顺铂耐药的宫颈癌细胞中lncRNA HOXD-AS1表达显著上调，下调lncRNA HOXD-AS1表达可抑制顺铂耐药宫颈癌细胞的耐药。上述研究验证了本研究结果，也提示lncRNA HOXD-AS1可能成为宫颈癌新的治疗靶点。

miRNA是一类内源性长约19～25个核苷酸的非编码RNA，可结合mRNA的3´UTR导致mRNA裂解，降解或抑制蛋白质翻译，参与细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等调控［5］。miR-133a-3p是一个低氧调节的miRNA，在心脏中含量最丰富，因此其异常表达

多与心脏相关疾病有关，如心肌梗死、心房颤动等［17-18］。近年研究［19-20］表明，miR-133a-3p还参与多种恶性肿瘤进展，HE等［19］发现miR-133a-3p可通过抑制Ⅰ型胶原A1抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和入侵。LI等［20］的研究显示，miR-133a-3p可通过调节叉状头转录因子3抑制胃癌增殖和自噬。本研究显示，宫颈癌组织中miR-133a-3p表达明显低于癌旁组织，且与FIGO分期、淋巴结转移有关，说明miR-133a-3p参与了宫颈癌进展。进一步分析显示，miR-133a-3p≥0.947患者术后3年总生存率明显提升，为术后预后不良独立保护因素，说明miR-133a-3p也可作为宫颈癌患者预后评估生物标志物。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路是促进宫颈癌细胞增殖、转移和抑制凋亡的关键通路［21］。研究［9］发现，上调miR-133a-3p表达可通过调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制宫颈癌细胞增殖、转移和促凋亡。lncRNA可作为内源竞争RNA竞争占有胞内微小RNA，海绵样缓冲削减并干涉靶基因mRNA编码蛋白能力［22］。本研究显示，宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1与miR-133a-3p表达呈负相关，说明二者可能共同影响宫颈癌患者预后。刘海娟等［9］通过miRcode数据库预测和双荧光素酶报告基因证实，miR-133a-3p与lncRNAHOXD-AS1的3´UTR存在结合位点，lncRNA HOXD-AS1能负向调控宫颈癌细胞凋中miR-133a-3p表达影响细胞增殖和凋亡。相反FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期和淋巴结转移患者的恶性程度增加，同时影响lncRNA HOXD-AS1和miR-133a-3p表达水平，进而影响患者的预后状态。

总之，宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1表达升高，miR-133a-3p表达降低；两者均与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移有关；lncRNA HOXD-AS1≥2.064为宫颈癌患者预后不良独立风险因素，miR-133a-3p≥0.947为其独立保护因素；二者可能成为宫颈癌患者预后评估指标。