红曲霉的初筛及在黄酒酿造中的应用

夏培禹，袁 宁，管桂坤，万自然，刘 宇，王 涛

（山东兰陵美酒股份有限公司，山东临沂 277731）

红曲霉（Monascus）是一种丝状腐生真菌，在生长代谢过程中可利用各种碳源及氮源生成次级代谢产物红曲色素，而红曲色素作为一种天然的可食用色素，在我国传统的食用和药用市场具有很好的应用前景。王柏琴等[1]利用红曲色素对pH值稳定、耐热、耐光及不易被氧化还原等特性，在香肠制作中将其取代对人体有害的亚硝酸钠用于发色，成色效果良好且稳定；Lee 等[2]已证明红曲色素中的黄色素具有降血压的作用，同时Su[3]发现红曲色素具有抗肿瘤、抗癌的作用。

红曲黄酒是最具有特色的黄酒之一，红曲作为糖化剂加入黄酒的发酵中，可使酒液呈现特殊的色泽，酒味醇厚香浓，口感淡雅、爽口宜人，主要品牌有福建老酒、沉缸酒及义乌丹溪红曲酒等[4]。红曲霉在黄酒的酿造中产生的代谢产物可分泌到酒中，除含有钙、磷、铁等元素，还含有硒、锰、铜、锌等微量元素，且黄敏欣等[5]研究发现，黄酒的发酵中添加红曲，可使γ-氨基丁酸的含量增加2.16 倍，可较好的提高黄酒的营养价值。同时红曲霉在发酵中产生的活性物质还具有阻碍胆固醇合成，降血脂，预防多种心脑血管疾病，提高免疫力、美容养颜等[6-7]功效。本文将从中温大曲中初筛的红曲霉，应用到黄酒的酿造中，探究其对黄酒风味口感的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

材料：中温大曲，山东兰陵美酒股份有限公司；黄酒专用活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；黍米，朝阳益充杂粮有限公司。

仪器设备：YXQ-LS-75SN 立式压力蒸汽灭菌锅；JHT-系列净化工作台；A-1502 分光光度计，上海谱元；MJX-280S 智能霉菌培养箱；FLY-211C 恒温振荡培养箱；安捷伦7890A气相色谱仪。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种筛选

将含有粉红色菌落的中温大曲曲心粉碎，分别加入无菌水中振荡摇匀，于60 ℃水浴中恒温30 min以杀死不耐热的细菌及酵母，吸取悬液用无菌水将其稀释成10-1～10-7的不同梯度，然后各吸取200 μL 的菌悬液涂布于麦芽汁固体培养基上，每梯度做两个平行。30 ℃恒温培养5 d，挑取红色菌落，进行平板划线纯化培养。然后根据菌落特征、颜色及所产香味等指标进行复筛，获得纯种单菌落。纯菌接入麦芽汁琼脂斜面培养基上备用[8]。

1.2.2 红曲米的制备

取斜面培养的红曲霉，接入灭菌的麦芽汁液体培养基中，于摇床150 r/min，30 ℃恒温培养3 d，然后将活化后的菌种培养液分别进行无菌过滤计数，将其浓度调整至2×106个/L，备用[9-10]。

500 mL 锥形瓶中装入50 g 大米，加水过夜浸泡，然后将其沥干，于灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，冷却后将其摇散，分别加入5 mL 调整好的2×106个/L 菌液，每组3 个平行，混匀后，30 ℃恒温培养箱中培养48 h 左右，米粒表面发白长满菌丝，之后每天进行两次摇瓶，使米粒分散，约10 d 米粒表面完全红透，烘干，获得红曲米成品[11]。

1.2.3 红曲糖化力测定

糖化力的测定参照GB 1886.174—2016[12]。

1.2.4 红曲酯化酶活力的测定[13]

测定方法为：3 mL 反应体系：乙酸对硝基苯酯240 μL（4.5 μg/μL）、粗酶液300 μL 和乙酸-乙酸钠缓冲液（pH6）2460 μL。混匀后测量OD405nm值并准确计时，在30 ℃水浴锅中反应2 h 后终止反应，再测定1 次OD405nm，根据所得OD 值计算反应体系中的酶活（酶活力单位定义：在一定条件下每1 min 释放出1 μmol 对硝基苯酚所消耗的酯化酶的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。

1.2.5 红曲中红曲色素的测定[7]

红曲色素提取及测定方法参照GB 1886.19—2015。将粉粹混匀的0.2 g 试样，用70%乙醇溶液溶解并将其转入100 mL容量瓶中，定容，60 ℃水浴1 h，冷却至室温，用70%乙醇溶液定容，混匀后过滤，50 mL 的容量瓶中加入适量滤液，70%乙醇溶液定容，混匀后，在505 nm 的波长下测定处理后样品中的吸光值A，并以下公式计算样品色阶：

X1=A×100/m1×50/V

式中：X1 为色阶（U/g）；A 为样品吸光值；m1 为样品质量（g）；V为吸取乙醇浸泡液的体积（mL）。

1.2.6 发酵操作

将浸泡20 h 以上的黍米蒸熟，黍米与水以1:2的比例加入锥形瓶中，待冷至常温，红曲米的添加量均为原料的10%，酵母添加量为原料的1‰，混匀，放入恒温培养箱30 ℃发酵，6 d 后测其酒度、总酸等指标。

1.2.7 黄酒风味物质检测

采用安捷伦7890A气相色谱仪检测[14]。

2 结果与分析

2.1 红曲霉菌株的筛选

通过分离、纯化和形态的初步鉴定，共获取3株红曲霉，分别命名为Q1、Q2及Q3，然后分别加入25%甘油中，于-20 ℃冰箱中保存，备用。

2.2 红曲米的理化性质（表1）

表1 红曲米的理化性质

将3 株筛选出的红曲霉分别以大米培养，所得红曲米的糖化力及红曲色素如表1 所示，中温大曲中筛选出的红曲霉Q3 的糖化力及红曲色素含量均明显高于另外两株红曲霉，且培养的红曲米符合GB 1886.19—2015 中对食品添加剂红曲米（粉）产品色阶≥1000 U/g 的要求。而酯化酶活力中，红曲霉Q1的活力则最高。

2.3 红曲酿造黄酒的理化指标（表2）

表2 黄酒的理化指标

由表2 可知，3 株筛选出的红曲霉培养的红曲米在黄酒发酵中的理化指标，其中总酸的含量相差不大，说明3 株红曲霉对黄酒酿造中总酸的产生量影响不大，而酒度及还原糖的含量则有明显的差异，红曲霉Q3 所产酒精含量最高，且剩余总糖的含量最低，说明该组黄酒发酵中的酒精转化率较高，而酒精转化率较高的原因可能与红曲霉Q3 的糖化力较高有关，可将原料较充分的糖化，以供酵母产生更多的酒精。而红曲霉Q2 的糖化力比Q1 高，酒精的产生量却比Q1 少，剩余总糖的含量也较高，推测可能是生成酒精的酵母在黄酒酿造中受到红曲霉Q2 的抑制，而红曲霉Q3 与Q1 对酵母生成酒精的影响不大，进而成为导致其酒精生成量相对少的原因。

2.4 红曲酿造黄酒中的高级醇含量（表3）

表3 黄酒中的高级醇含量 (mg/L)

适宜的高级醇含量能赋予黄酒以柔和、醇厚、圆润、丰满及协调的感觉，而高级醇在体内的氧化速度比乙醇慢，因此会停留较长时间，当黄酒中含有过量的高级醇，消费者饮用黄酒易“上头”，易醉，同时会引起脑部损伤及认知障碍[15]。由表3可以看出，3 株筛选出的红曲霉在黄酒发酵中产生的高级醇含量存在差异性，红曲霉Q3 在黄酒发酵中所产生的总高级醇含量明显低于另外筛选出的两株红曲霉，推测可能是红曲霉Q3 在黄酒发酵中会影响高级醇的生成途径，或会以消耗高级醇为碳源促进自身的生长增殖，进而导致高级醇的生成量相对减少。

2.5 黄酒中乙酸及两种相关酯的含量

酯类物质是黄酒中重要的风味物质，对黄酒的风味和品质起着关键性的作用，通常具有很强的水果味或花香味[16]。黄酒中酯的种类多但产生量较少，故将含量较高且差异变化较明显的两种酯由表4 列出，可以看出，红曲霉Q3 在黄酒酿造中不论是乙酸乙酯还是乳酸乙酯的产生量均高于另外两株红曲霉，且乙酸乙酯的产生量均高于其他两株红曲霉的2 倍。虽然红曲霉Q3 的酯化酶活力在3 株菌中不是最高，但在黄酒酿造中，乙酸乙酯及乳酸乙酯的产生量却是最高的，从乙酸的含量推测可能是红曲霉Q3 在黄酒酿造中会促进乙酸菌等微生物产生较多的乙酸，同时促进乳酸菌等微生物产生较多的乳酸，进而使得具有酯化能力的红曲霉Q3 将其分别转化为相应的酯类物质。虽然红曲霉Q1 的酯化能力最高，但两种酯的含量却较低，可能由于在黄酒酿造中红曲霉Q1 对各类酯相应的有机酸类物质产生量较少，从而导致后期酯的产生量相对较少。

表4 黄酒中乙酸及两种相关酯的产生量(mg/L)

3 总结

中温大曲中筛选出的红曲霉Q3 培养的红曲米，不论在糖化力还是产红曲色素的能力方面都要优于另外两株红曲霉Q1 及Q2。3 株红曲霉在黄酒酿造中，在对总酸的产生量无明显影响的情况下，

红曲霉Q3 发酵后的剩余总糖量最低，酒精产量最高，说明其在发酵过程中能更好的利用原料，提高酒精含量，同时也可在发酵中通过抑制高级醇的生成途径或以其为碳源满足自身生长增殖，从而使得产生的高级醇含量要低于其他两株红曲霉。乙酸乙酯及乳酸乙酯作为黄酒中重要的风味物质，在黄酒的风格方面影响很大。3 株红曲霉中红曲霉Q1的酯化酶活力最高，但在黄酒发酵中产生的乙酸乙酯及乳酸乙酯的含量却不是最高。而红曲霉Q3 产生的乙酸乙酯及乳酸乙酯的含量最高，说明红曲霉Q3 能够提高黄酒液态发酵中的酯化能力。而从红曲霉Q3 产生较高的乙酸含量推测，可能是红曲霉Q3 会促进乙酸菌等微生物产生乙酸，亦可促进乳酸菌等微生物产生乳酸，使得乙酸乙酯及乳酸乙酯的前体物质产生量较多，进而导致其相应酯的含量增高。因此，黄酒酿造中的中温大曲中初筛选出的红曲霉Q3 在提高原料利用率，提高酒精含量，改进产品风格等方面有很好的应用前景。