蛋白酶对黄酒发酵的影响及挥发性成分分析

陈 通，芮鸿飞，叶林林，胡 浩，郭 俭，刘兴泉，

（1.浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江杭州 311300；2.杭州市临安区疾病预防控制中心，浙江杭州 311300；3.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州 311300）

黄酒是世界三大古酒之一[1]，是以麦曲为主要糖化剂，经长期陶坛陈酿而成的风味饮品，独特的酿造工艺造就了黄酒独有的风味特征[2-3]。麦曲是黄酒发酵中最常用的糖化发酵剂，除积累了根霉、米曲霉、细菌及其代谢产物外，还富含糖化酶、淀粉酶、蛋白酶等酶类[4]。在黄酒酿造过程中，麦曲中的各种酶系将原料中淀粉、蛋白质等降解为酵母及其他微生物可利用的营养物质，同时为黄酒增香[5]。

随着酿酒工业的发展，酶制剂广泛应用于发酵酒的生产中。啤酒中，酶制剂主要用于啤酒澄清[6]；葡萄酒中，主要集中于增香剂的研发[7-9]；黄酒同为三大古酒，主要集中在酸性蛋白酶的研究上。酸性蛋白酶能加速蛋白质的水解，增加可利用的氮源，促进酵母生长并有效控制乳酸菌等杂菌的繁殖，从而减少了酸、醛等副产物的产生[10]；且黄酒醪液中酒精度、氨基酸态氮含量与酸性蛋白酶的添加量成正比[11-12]。蛋白酶促进游离氨基酸的释放,提高黄酒挥发性成分的形成，显著改变黄酒风味组成[13-14]。

为进一步探究蛋白酶在黄酒生产中应用的可行性，本试验选取3 种食品级蛋白酶（风味蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶），探讨蛋白酶的添加对黄酒发酵及挥发性成分的影响，为提升黄酒风味品质提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米，安徽南陵米业有限公司；黄酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；麦曲，绍兴古越龙山黄酒股份有限公司；风味蛋白酶（20000 U/g）、中性蛋白酶（60000 U/g）、复合蛋白酶（120000 U/g），北京索莱宝科技有限公司；2-辛醇（纯度＞99.8%），美国sigma公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪：QP-2010 GC/MS，日本岛津公司，配RTX-WAX 毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm）；100 μm PDMS 萃取头及SPME手动柄，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黄酒酿造工艺流程

1.3.2 黄酒发酵实验

糯米∶水∶麦曲∶酵母=500∶500∶50∶1，以风味蛋白酶添加量100 mg/L[15]为基准，控制3 种蛋白酶的酶活当量相同，中性蛋白酶、复合蛋白酶的添加量分别为33.3 mg/L、16.7 mg/L。

蛋白酶经50 ℃活化30 min 后，与黄酒活性干酵母混匀后接种于酒坛；30 ℃有氧糖化3 d，每12 h开耙1 次；前酵（4～7 d，15 ℃密封发酵，每48 h 开耙1 次）；中酵（8～12 d，15 ℃密封发酵，每3 d 开耙1 次，）；后酵（13～34 d，15 ℃密封发酵），发酵结束后90 ℃灭菌30 min，灌装待测。

1.3.3 黄酒常规指标的测定

总糖、总酸、酒精度的测定参考国标GB/T 13662—2018《黄酒》。

1.3.4 黄酒挥发性成分的测定[16]

1.3.4.1 样品处理

PDMS 萃取头使用前先在气相色谱进样口250 ℃活化30 min；20 mL 顶空瓶中准确加入5 mL黄酒样品、5 mL 去离子水和20 μL 内标2-辛醇（1.143 mg/mL 乙醇溶液），加盖密封垫和铝帽，50 ℃预热5 min 后，PDMS 萃取头萃取吸附30 min，进样口250 ℃条件下GC解析15 min。

1.3.4.2 色谱条件

GC 条件：色谱柱为RTX-WAX 弹性石英毛细管柱(30 m×0.35 mm×0.25 μm)，以氦气(99.999%)为载气，恒定流速为1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，不分流进样；柱温采用程序升温，初始温度为40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min 升温到120 ℃，保持5 min，再以3 ℃/min升温到190 ℃，保持5 min。

MS 条件：EI 源，电子能量70 eV，全扫描模式采集数据，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，扫描范围为40～500 u，溶剂切除3 min。

1.3.4.3 定性定量方法

采用NIST08 和NIST08s 标准图谱库进行检索，以匹配度大于80%作为检索结果；以检测出物质的峰面积与内标2-辛醇峰面积的比值来确定挥发性成分的相对含量。按照以下公式计算各种挥发性香气成分相对含量：

其中：Ai——各种香气成分对应峰面积；

Aj——内标峰面积。

1.3.5 酵母菌的计数

采用血球计数板计数法。

1.3.6 数据分析

采用Excel 2016 和SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，用TBtools 和GraphPad 8.0 软件作图，每组试验设置3 组重复，结果以均值±标准差（means ±SD）表示，在p ＜0.05水平上差异显著。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的添加对黄酒发酵过程的影响

测定了黄酒发酵过程中总糖和酵母菌数，结果见图1。由图1 可知，添加风味蛋白酶能显著提高总糖的利用率，而复合蛋白酶的添加使总糖的消耗速率下降。处理组与对照组的酵母菌数变化趋势相似，在发酵第7 天达到最高值，在第16 天趋于稳定。其中风味蛋白酶显著地促进了酵母菌的生长，最高峰值达3.18×108cfu/mL，比对照组上升了15.7%，并在后期稳定时保持较高的水平，为1.68×108cfu/mL。风味蛋白酶促进糯米中大分子的蛋白质水解成小分子肽和游离氨基酸，更易于被酵母吸收利用[17]，促进酵母生长，并提高酵母细胞对糖的转化速率[18]。酵母可利用氮源的缺乏或过量都会影响细胞的生长，而且氮源水平与细胞生长速度呈正相关[19-21]。

黄酒总糖、总酸、酒精度和氨基酸态氮含量结果见图2。酒精度是基于醪液发酵过程中酵母细胞所转化的糖总量。由图2 可知，添加风味蛋白酶所酿黄酒的氨基酸态氮与酒精度最高，总糖、总酸含量最低。其中氨基酸态氮含量为0.43 g/L，酒精度为15.1%vol，较对照组分别上升了30.3%、5.6%，结合总糖含量变化规律（图1a），说明风味蛋白酶的添加促进酵母生长，使得更多的糖转化为酒精，与蔡小云的研究结果相似[22]。添加风味蛋白酶的黄酒总酸为6.6 g/L，较对照组下降了8.3%，而添加中性蛋白酶与复合蛋白酶的黄酒总酸与对照组差异不显著。

表1 添加蛋白酶黄酒挥发性成分的分析

2.2 蛋白酶的添加对黄酒挥发性成分的影响

黄酒有着独特的香气特征，其中醇、酸、酯类物质是主要的香气物质，起香气骨架的作用[23-25]。采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用仪（HSSPME-GC/MS）测定了黄酒挥发性物质，筛选了32种主要的挥发性成分（14 种酯、10 种醇、4 种酸和4种其他物质）进行分析，结果见表1。与对照组相比，添加蛋白酶显著促进了高级醇和酯的合成，抑制了酸的合成。其中，添加风味蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶对总酯的促进率分别为97.6%、155.1%、261.0%。蛋白酶增加了醪液中的氨基酸态氮含量（见图2b），促进了酵母细胞对氮源的吸收利用，从而增强了风味物质的形成。在黄酒发酵过程中，提高醪液中氮源水平可促进酯的形成[26-27]。

2.3 黄酒挥发性成分的主成分及聚类热图分析

对表1 中32 种香气物质进行主成分及聚类热图分析，结果见图3。主成分分析表明不同酒样与风味物质之间的联系。图3a 显示风味物质分布在4 个象限中，其中肉豆蔻酸乙酯（r=0.999）、琥珀酸二乙酯（r=0.992）、己酸乙酯（r=0.990）、乙酸异戊酯（r=0.987）和乙酸乙酯（r=0.982）等物质集中分布在第一象限，均对第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）有较大的正向影响。结合图3b 表明这类物质与添加风味蛋白酶的黄酒有较大的相关性，说明风味蛋白酶能促进黄酒中肉豆蔻酸乙酯、琥珀酸二乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸乙酯等物质的生成并改善黄酒的风味品质。

表2 10种黄酒挥发性成分香气活力值的评价

聚类热图结果见图3c，不同颜色表示各香气化合物的含量差异，红色表示含量高，绿色表示含量低。基于香气化合物含量进行聚类，结果显示，32种化合物在不同酒样中的分布可以聚为4 类。其中化合物含量C 类＞D 类＞A 类＞B 类。在不同黄酒样品中差异最显著的是C 类化合物，包括异戊醇、乙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、丁酸乙酯和棕榈酸乙酯，与对照组相比，蛋白酶的添加显著提高了这些化合物的含量。

2.4 黄酒香气贡献率的分析

为了进一步比较各香气化合物对黄酒整体香气的贡献，根据文献[28-33]报道中各香气化合物的香气描述及香气阈值浓度，计算各香气化合物在黄酒中的OAVs，结果见表2。丁酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯等化合物具有浓郁的水果香，添加蛋白酶后其OAVs＞1，表明这些香气物质对黄酒香气特征具有明显的贡献。其中风味蛋白酶对乙酸异戊酯、己酸乙酯和癸醛的贡献率促进效果最好，分别是对照组的5.6 倍、1.3 倍、1.5 倍；复合蛋白酶对丁酸乙酯、棕榈酸乙酯的贡献率提升最显著，分别是对照组的30.2倍、3.31倍。

4-乙基愈创木酚具有典型的辛辣、刺激的烟气味，是构成我国黄酒“烟气香”风味特征的重要香气化合物[34]。黄酒中酚类化合物可能主要来自植物原料中木质素及其他植物次级代谢产物[35]。中性蛋白酶、复合蛋白酶增加了4-乙基愈创木酚在黄酒中的贡献率，分别是对照组的1.2 倍、1.3 倍，而风味蛋白酶抑制了4-乙基愈创木酚的产生，消除了辛辣、刺激气味，营造了浓郁协调的香气氛围。

3 结论

蛋白酶的添加显著影响黄酒发酵，其中风味蛋白酶最显著。与对照组相比，风味蛋白酶促进了蛋白质分解，氨基酸态氮含量增加了30.3%，酵母菌数上升了15.7%，酒精度增加了5.6%，总酸下降了8.3%；中性蛋白酶的促进效果比不上风味蛋白酶；而复合蛋白酶提高了总酸含量，导致黄酒酸败。

蛋白酶的添加可显著促进高级醇和酯的形成。通过主成分与聚类热图分析发现，风味蛋白酶促进β-苯乙醇、异戊醇、乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯等香气物质的生成，这类物质集中分布在第一象限，对PC1、PC2 均有正向作用。风味蛋白酶提高了异戊醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯等物质对黄酒整体香气的贡献（OAVs 增大），降低了辛辣、刺激气味。而添加中性蛋白酶和复合蛋白酶的黄酒风味比不上对照组。3 种蛋白酶中，风味蛋白酶的添加能显著改善黄酒风味品质，为提升黄酒风味品质的技术提供参考。