脓毒症患者循环miR-21、miR-155变化与炎症细胞因子和心功能障碍的相关性

贾启明 张涛 贺娜娜 魏蕾

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，可进一步发展为脓毒症休克并引起多器官功能障碍的发生，病死率高、救治难度大。心脏是脓毒症病程中常见的受累靶器官，脓毒症患者体内炎症反应的级联放大激活、炎症细胞因子的大量释放会引起心肌细胞损害、造成心脏舒缩功能减退，在此基础上可出现循环障碍并加速休克及多器官功能障碍的发生［1-2］。近年来，多种微小RNA（microRNA，miR）被证实参与脓毒症、心肌损伤、炎症反应的过程，其中miR-21 及miR-155 两种miRs 在脓毒症患者的循环中呈显著高表达［3-4］。miR-21 和miR-155可能靶向调节多种炎症细胞因子的表达及分泌，但脓毒症合并心功能障碍患者循环miR-21 及miR-155 的变化、与炎症因子分泌的关系及临床意义尚未见报道。因此，本研究将观察脓毒症患者循环miR-21，miR-155 变化与心功能障碍、炎症细胞因子的相关性，分析miR-21，miR-155 变化与脓毒症合并心功能障碍患者循病情及预后的相关性，以期为临床评价脓毒症合并心功能障碍患者的病情及预后提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年3月至2018年12月期间在本院诊断为脓毒症的58例患者作为研究对象。入组标准：①符合脓毒症的诊断标准［5］；②临床资料与预后资料完整；③入院后24 小时内接受心脏多普勒超声检查；④入院后24 小时内留取静脉血及血清标本。⑤所有患者及家属均已签署知情同意书；排除标准：①合并或既往有病毒性心肌炎、心肌梗死；②合并恶性肿瘤、结缔组织病；③脓毒症前已经出现心功能障碍。根据入院后24 小时内心脏多普勒超声结果分为LVEF＜50%组及LVEF≥50%组。另取同期在本院体检的健康志愿者40例作为对照组。本实验已通过本院伦理委员同意批准。

1.2 方法

1.2.1 心功能的测定

脓毒症患者入院后24 小时内接受床旁心脏多普勒超声检查，对照组志愿者体检时进行心脏多普勒超声检查，探头频率1-5MHz，获取胸骨旁左心室长轴图像后测量左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.2.2 循环miR-21，miR-155 表达的检测

脓毒症患者入院后24 h 内采集肘静脉血3 mL，对照组志愿者体检时采集肘静脉血3 mL，采用血液RNA 提取试剂盒（北京百奥莱博公司、批号：BTN3071-IQS）提取RNA，采用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根公司、批号KR211）反转录合成cDNA，采用miRNA 荧光定量PCR 检测试剂盒（北京天根公司、批号FP401）对miR-21、miR-155、U6进行扩增，miR-21 的上游引物为5′-GATCCTAGCATCGTAGCTA-3′、下游引物为试剂盒通用引物，miR-155 的上游引物为5′-TAGCTAGCTAGCTAGCTA-3′、下游引物为试剂盒通用引物；U6 的下游引物为5′-TAGATCGTATAGCTAT-3′、下游引物为5′-TAAGCTAGCTAGCTAGCTA-5′。扩增程序为：95℃3 min 后95℃15 s、60℃30 s，重复40 个循环，得到循环曲线及循环阈值（Ct），以U6 为内参，按照公式2-ΔΔCt计算miR-21、miR-155的相对表达水平。

1.2.3 血清生化指标及细胞因子的检测

脓毒症患者入院后24 h 内采集肘静脉血3 mL，对照组志愿者体检时采集肘静脉血3 mL，离心分离血清后采用全自动生化分析仪（贝克曼库尔特公司，型号AU5800）测定C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（Procalcitonin，PCT）、肌钙蛋白I（Cardiac tropnin I，cTnI）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）的含量，采用上海酶联公司生产的酶联免疫吸附法试剂盒检测肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor - α，TNF - α）（批号：ml077385）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）（批号：ml028590）、细胞间黏附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）（批号：ml060413）的含量。

1.2.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行数据分析，计数资料用n（%）表示，行χ2检验；计量资料用（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。相关性分析采用Pearson 检验，多因素分析采用logistics 回归分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组一般资料的比较

3 组间性别、年龄、BMI 的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；血清CRP、PCT、cTnI、BNP 含量比较结果：LVEF＜50%组＜LVEF≥50%组＜对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3 组一般资料的比较（±s）Table1 ccomparison of general data among 3 groups（±s）

表1 3 组一般资料的比较（±s）Table1 ccomparison of general data among 3 groups（±s）

资料性别（男/女）年龄（岁）BMI（kg/m2）CRP（mg/L）PCT（ng/mL）cTnI（ng/mL）BNP（ng/L）对照组（n=40）23/17 42.39±9.59 22.93±5.82 3.28±0.62 0.58±0.08 0.45±0.08 32.93±7.95 LVEF≥50%组（n=38）22/16 45.12±10.92 23.14±6.14 30.38±7.82 3.29±0.68 0.68±0.12 63.29±10.29 LVEF＜50%组（n=20）12/8 40.39±11.87 22.46±5.67 61.39±9.94 14.69±3.94 1.52±0.20 132.29±21.29Z/F 值0.036 1.432 0.087 530.616 417.803 481.609 417.546P 值0.982 0.244 0.917 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 3 组循环miR-21，miR-155 及血清炎症因子的比较

3组循环miR-21，miR-155表达量及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量比较结果显示：LVEF＜50%组最高，其次是LVEF≥50%组，对照组最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 3 组循环miR-21，miR-155 及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 的比较（±s）Table2 comparison of circulation miR-21，miR-155 and serum TNF-α，IL-2，ICAM-1 among 3 groups（±s）

表2 3 组循环miR-21，miR-155 及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 的比较（±s）Table2 comparison of circulation miR-21，miR-155 and serum TNF-α，IL-2，ICAM-1 among 3 groups（±s）

组别对照组LVEF≥50%组LVEF＜50%组F 值P 值n 40 38 20 miR-21 1.02±0.19 1.42±0.23 2.19±0.42 129.091 0.000 miR-155 0.97±0.16 1.38±0.19 1.83±0.32 113.378 0.000 TNF-α（ng/L）9.38±1.32 20.19±4.82 57.92±9.94 543.380 0.000 IL-2（ng/L）14.28±2.37 32.93±6.48 82.93±13.28 586.608 0.000 ICAM-1（ng/mL）126.49±17.96 349.58±62.39 649.39±85.93 592.120 0.000

2.3 LVEF＜50%组miR-21，miR-155 与血清指标的相关性

LVEF＜50%组患者的循环miR-21，miR-155表达量与血清CRP、PCT、cTnI、BNP、TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量均呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）见表3。

表3 LVEF ＜50%组miR-21，miR-155 与血清指标的相关性Table3 correlation between miR-21，miR-155 and serum index in LVEF ＜50%group

2.4 LVEF＜50% 组中存活及死亡患者循环miR-21，miR-155 及血清炎症因子的比较

LVEF＜50%组中死亡患者的循环miR-21，miR-155 表达量及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量均明显高于存活患者，差异有统计学意义（P＜0.05）见表4。

2.5 LVEF＜50%组患者治疗结局的相关因素

以LVEF＜50%组患者是否死亡作为治疗结局的应变量，以循环miR-21，miR-155 及血清CRP、PCT、cTnI、BNP、TNF-α、IL-2、ICAM-1 作为自变量进行logistics 回归分析，miR-21，miR-155 表达量与血清PCT、TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量增多是LVEF＜50%的脓毒症患者死亡的危险因素，血清CRP、BNP 与LVEF＜50%的脓毒症患者死亡无明显关系见表5。

3 讨论

脓毒症累及心脏时可引起心功能障碍并增加患者死亡率。脓毒症患者发生心功能障碍的主要病理生理机制是体内炎症反应的级联放大激活［6-7］。相关研究表明，miR-21 和miR-155 分别靶向JAK2/STAT3 通路、TLR4 通路来发挥抑制炎症反应的作用［8-10］；在脓毒症患者的循环血中，miR-21及miR-155 的表达均明显增多［3-4］。在此基础上，本研究分析了miR-21 及miR-155 在脓毒症合并心功能障碍中的应用价值并发现miR-21 及miR-155表达增多与脓毒症患者心功能障碍的发生有关，与与已有的脓毒症相关研究一致，出现这一变化的原因可能与机体的代偿机制有关，在脓毒症患者炎症反应过度激活的过程中、miR-21 及miR-155表达代偿性增多以起到保护作用。

表4 LVEF ＜50%组中存活及死亡患者循环miR-21，miR-155 及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 的比较［n，（±s）］Table4 comparison of circulation miR-21，miR-155 and serum TNF-α，IL-2，ICAM-1 between survival and death patients in LVEF ＜50%group［n，（±s）］

表4 LVEF ＜50%组中存活及死亡患者循环miR-21，miR-155 及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 的比较［n，（±s）］Table4 comparison of circulation miR-21，miR-155 and serum TNF-α，IL-2，ICAM-1 between survival and death patients in LVEF ＜50%group［n，（±s）］

LVEF＜50%组存活患者死亡患者t 值P 值n 12 8 miR-21 1.57±0.27 2.75±0.54 6.505 0.000 miR-155 1.48±0.23 2.18±0.41 4.906 0.000 TNF-α（ng/L）41.23±7.42 74.61±13.28 7.233 0.000 IL-2（ng/L）62.58±10.38 106.61±18.59 6.817 0.000 ICAM-1（ng/mL）501.23±68.69 795.51±101.29 7.777 0.000

表5 LVEF ＜50%组患者治疗结局的相关因素分析Table5 related factors analysis of treatment outcome of patients in LVEF ＜50%group

炎症反应激活是造成脓毒症患者发生心功能障碍的重要因素，CRP 及PCT 是用于评价脓毒症病情的指标［11-12］，cTnI 及BNP 是用于评价心肌损害及心功能减退的指标［13-14］。本研究的分析证实，在脓毒症患者心功能恶化的过程中，CRP、PCT、cTnI、BNP 含量均明显高于且LVEF＜50%组患者miR-21，miR-155 表达量与血清CRP、PCT、cTnI、BNP 呈正相关，说明循环miR-21，miR-155 表达量的增多与脓毒症合并心功能障碍病情发展变化相关，结合miR-21 及miR-155 所介导的抑炎作用推测，脓毒症合并心功能障碍病情发展变化过程中miR-21及miR-155 的增多不足以代偿机体炎症反应的级联放大激活，心肌损伤仍然发生了损伤。

miR-21，miR-155 的主要生物学作用是抑制炎症反应，脓毒症合并心功能障碍患者循环miR-21，miR-155 表达量的增多可能是机体自我保护的代偿机制。TNF-α、IL-2、ICAM-1是在脓毒症过程中介导炎症反应的重要细胞因子［15-17］。本研究对炎症因子的分析证实，在脓毒症患者心功能恶化的过程中，血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量均明显升高且LVEF＜50%组miR-21，miR-155 表达量与血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 呈正相关，这一相关性与miR-21 及miR-155 介导的抑炎作用不一致，其可能的原因是脓毒症患者体内miR-21，miR-155 的增多不足以代偿炎症反应的放大激活，导致炎症的感染因素仍持续存在，因此出现了多种炎症细胞因子的大量释放。

最后，本研究还对脓毒症患者的预后进行了随访，通过比较死亡患者与存活患者miR-21，miR-155 的差异可知，循环miR-21，miR-155 表达量的增多与治疗结局有关，死亡患者的循环miR-21，miR-155 表达量均明显高于存活患者。进一步通过logistics 回归分析验证miR-21，miR-155 表达量与脓毒症合并心功能障碍患者治疗结局的关系可知：miR-21，miR-155 表达量增多是脓毒症合并心功能障碍患者死亡的独立危险因素，说明miR-21，miR-155 表达量对脓毒症合并心功能障碍患者的预后具有评估价值。

综上所述，脓毒症患者循环miR-21，miR-155明显增多与心功能障碍有关、同时也是影响脓毒症合并心功能障碍患者预后的危险因素，未来miR-21，miR-155 不仅能够作为评价脓毒症合并心功能障碍患者病情及预后的标志物。