骨形态发生蛋白7协同蛇床子素促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

杨洲，王乾，金镇雄，邱丽玲，高翔，施杞，唐德志

1.泰州市中医院软伤正骨科，江苏泰州225300；2.上海中医药大学脊柱病研究所，上海200032；3.复旦大学附属华东医院伤外科，上海200040

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是一种具有分化成软骨、骨、神经和脂肪等潜能的非造血干细胞。研究显示BMSCs 分化成骨细胞的过程中，其增殖受骨钙素（osteocalcin, OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein, BSP）、成骨细胞特异性转录因子（Osterix）和Runt 相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2, RUNX2）等多种激素、信号通路及细胞因子的共同调节[1]。而骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）和转化生长因子-（transforming growth factor- , TGF- ）又被认为是影响BMSCs 增殖的主要细胞因子[2]。骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7, BMP7）是一种决定细胞形态分化的物质，对骨骼和肾脏发育起着重要促进作用。BMP7 不仅维持着正常的肾脏结构形态，还发挥着重要的损伤修复作用，能使BMSCs 诱导分化为软骨细胞和成骨细胞[3]。

药理学研究[4]表明蛇床子素具有抗骨质疏松、抗氧化、抗心率失常和类激素样等作用。进一步实验[5]显示蛇床子素可以通过作用于BMP 信号通路调节骨吸收和骨形成之间的动态平衡，进而实现抗骨质疏松。此外，团队前期研究发现蛇床子素可以通过提高BMP2和BMP4 的表达，促进成骨细胞的增殖和分化[6]。然而，蛇床子素与BMP7 促进成骨的相互关系尚不清楚。因此，本文以BMP7 与BMSCs 在成骨方面的联系为切入点，研究BMP7 介导的蛇床子素对BMSCs成骨的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心提供的1月龄雌性SPF级C57BL/6 小鼠10 只，合格证号：2007000556345。

1.2 实验仪器 光学显微镜（Olympus BH-20），高速离心机（Eppendorf），紫外分光光度计（Beckonman，DU 800/VIS），荧光PCR 仪（Rotor Gene 3000），电热恒温培养箱，Varioskan Flash 全波长扫描多功能读数仪等。

1.3 实验试剂Trizol、SYBR Green 荧光素酶（大连宝生物工程有限公司），PCR 引物（北京华大基因研究中心），青-链霉素、逆转录试剂盒（PAA 公司），MTT、二甲基亚砜（Sigma 公司），Noggin 纯化蛋白、BMP7纯化蛋白（Abcam 公司）和蛇床子素（上海普盛生物科技有限公司）等。

1.4 实验方法与分组

1.4.1 BMSCs 的分离培养 小鼠脱颈椎处死后，以75%酒精浸泡10 min，将小鼠的股骨和胫骨钝性分离，用含有10%胎牛血清和100 U/mL 青-链霉素的高糖-MEM细胞培养基将髓腔内的骨髓细胞冲入平皿内，得到单细胞悬液。将细胞按每孔2 mL 的标准接种在6 孔培养板上，最后置于37℃、5%CO2培养箱中。24 h后将未贴壁细胞转入另一培养板继续培养，每3 天换液1 次，当贴壁层细胞达到90%以上融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后继续接种于培养板上。小鼠BMSCs按前期研究文献所述方法进行分离培养鉴定[7]。

1.4.2 实验分组和干预方法 实验分为6 组：空白对照组、蛇床子素组、BMP7 组、Noggin 组、蛇床子素+BMP7 组及蛇床子素+Noggin 组。待BMSCs 在培养板上长满50%时，依次加入蛇床子素、BMP7 纯化蛋白、Noggin 纯化蛋白、蛇床子素+BMP7 纯化蛋白以及蛇床子素+Noggin 纯化蛋白。BMP7 纯化蛋白的剂量均为100ng/L，蛇床子素的剂量均为10-6mol/L，Noggin纯化蛋白的剂量均为100 ng/L，空白对照组不添加任何药物。3 d 换液1 次，培养24 h、48 h、72 h 后抽取细胞核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）。

1.4.3 MTT 法检测原代BMSCs 在96 孔培养板中以1×104孔的密度进行接种，用100L 含10%胎牛血清的-MEM 放于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。3d换液1 次，分别于接种2h、4h、8h、24h、48h 和72 h 时选取6 孔进行观测。观测时先将培养液吸出弃掉，并将20L 噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT）溶液（5 mg/mL）加入每个培养孔，并且在37℃下孵育4 h，停止BMSCs 培养。将上清液完全吸去后，每孔添加150L 二甲基亚砜充分振荡溶解，在490 nm 波长下检测其吸光值，计算原代BMSCs 的增殖程度。

1.4.4 实时荧光定量PCR 检测

1.4.4.1 提取细胞总RNA 取出培养的BMSCs，用0.1M 的PBS 冲洗BMSCs3 遍，加入Trizol（0.5mL/孔），移液器吹打细胞至溶解后，将裂解液移入1.5 mL EP管中，在室温下放置5 min。加入氯仿0.2 mL，剧烈震摇15 s，于室温下静置2 min，4℃、12 000 rpm 离心15 min，吸取上层水相，置于新的灭酶EP 管中。而后各管加入异丙醇0.5 mL，摇匀，4℃、12 000 rpm离心15 min，弃掉上清液。加入5%乙醇1 mL，摇匀，4℃、12 000 rpm 离心5 min，吸取上清。将管内沉淀置于超净台干燥5 min，每管加0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水20L，摇匀，得总RNA 溶液。

1.4.4.2 RNA 的含量和纯度测定 在石英比色杯中分别加入2L RNA 溶解液和98 mL DEPC 水，移液枪混匀。用分光光度计测样品A260 和A280 光密度值，结果比值在1.6～2.0 之间，随后进行逆转录和复制。

1.4.4.3 逆转录反应 配置20 L 的逆转录体系，200 L的EP 管置于冰上，按照20L 的反应体系加入500ng提取的细胞总RNA，开始逆转录，分别添加4L 5×RT prime Script Buffer、1L Oligo dT 引物、1L 6 核苷酸随机引物、1L 逆转录酶，RNA 溶液和无RNA酶的水共计13L，将上述混合液轻轻震荡混匀后，以1 000 rpm 离心30 s 后放入PCR 仪进行逆转录；37℃反应15 min，85℃反应5 s，置于冰上停止反应，得到逆转录cDNA，-20℃进行存储。

1.5 统计学分析 采用SPSS 21.0 进行统计学分析，计量资料以均数±标准差±s）表示，多组间数据比较应用单因素方差分析，若方差齐用LSD 检验，若方差不齐采用Dunnett T3 法；2 组间比较应用独立样本检验，方差不齐时用非参数检验，＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代BMSCs 增殖 原代BMSCs 在2 h、4 h、8 h和24h 细胞增殖缓慢，24h～72h 细胞增殖开始进入对数期，经过72h 的培养细胞增殖达到最大值。见图1。

图1 原代BMSCs 增殖

2.2 加药后原代BMSCs 中成骨基因的表达 加药72 h内，蛇床子素组BMSCs 中的成骨基因表达持续升高（＜0.05），BMP7 组BMSCs 中的促表达作用不明显，但可以提高的表达（＜0.05）。

与空白对照组比较，Noggin组与蛇床子素+BMP7组均可以提高的表达；BMP7 组基因表达水平较低。蛇床子素+Noggin 组可以使BMSCs 中呈高水平表达状态，且在加药48 h 后达最大值，随后开始下降，但其表达水平仍较空白对照组高。见表2。

加药24 h 后，BMP7 组和蛇床子素+BMP7 组中BMSCs 的表达最高，但随着时间延长BMP7 组BMSCs 中的表达逐渐下降，而蛇床子素+BMP7组BMSCs 中的表达量维持在较高水平，约为空白对照组的1.66 倍（＜0.01）。Noggin 组BMSCs 中的表达量一直维持在较低水平＜0.05），而蛇床子素+Noggin 组的基因表达量均较Noggin 组提高＜0.05）。与空白对照组比较，加药24 h 后，BMP7 组和蛇床子素+BMP7 组中的基因表达水平最高，Noggin 组表达最低＜0.05）。见表3。

3 讨论

BMSCs 作为一种具有多向分化潜能的种子细胞，在骨和软骨的发生发展中起着重要的作用，对BMSCs成骨分化机制的研究有助于促进其在骨折愈合和软骨损伤中的临床应用。研究发现[8]BMP 可以诱导BMSCs向成骨细胞分化和骨形成，而BMP7 作为具有较强成骨作用的生长因子，被广泛应用于骨缺损修复研究中。

蛇床子素是中医传统补肾强骨中药蛇床子的有效成分，现代药理学显示蛇床子素可以通过抑制骨吸收、增加骨量、维持骨代谢平衡发挥预防骨质疏松和促进骨折愈合的作用[9]。Noggin 纯化蛋白是一种BMP 信的号通路的抑制剂，通过对BMP7 介导蛇床子素，促进BMSCs 成骨分化。本次研究发现Noggin 纯化蛋白对BMSCs 成骨基因的表达具有显著的抑制作用。而蛇床子素不仅可以提高BMSCs 成骨基因的表达，特别是基因的表达，而且可以一定程度上逆转Noggin 纯化蛋白对以及下游成骨相关基因表达的抑制。

表1 实时定量PCR 引物序列

表2 原代BMSCs 中的基因表达（±s）

表2 原代BMSCs 中的基因表达（±s）

注：与同一时间点空白对照组比较，＜0.05、＜0.01

成骨基因 空白对照组 蛇床子素组 BMP7 组 Noggin 组 BMP7 组素+Noggin 组images/BZ_41_334_538_359_562.pngimages/BZ_41_380_545_402_569.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_334_738_359_762.pngimages/BZ_41_380_745_402_769.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_334_938_359_962.pngimages/BZ_41_380_945_402_969.pngimages/BZ_41_400_938_421_962.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_334_1138_359_1162.pngimages/BZ_41_380_1145_402_1169.png24 h 48 h 72 h 1.00±0.04 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.08 1.00±0.05 1.00±0.25 1.00±0.16 1.00±0.12 1.00±0.11 1.00±0.29 0.65±0.10 1.07±0.14**1.51±0.08 0.76±0.09 1.11±0.15**1.22±0.16*0.63±0.12 0.96±0.13**0.86±0.13**0.84±0.04 1.11±0.13*1.59±0.01 0.72±0.04*0.45±0.10**0.68±0.08*0.66±0.11**1.00±0.05**0.82±0.07**0.53±0.07**0.71±0.13**1.19±0.18**0.54±0.07 0.89±0.09 1.34±0.10 0.91±0.15 2.31±0.15*2.64±0.21**1.47±0.05**1.97±0.07**1.66±0.07**0.95±0.04*1.23±0.05*1.28±0.09 0.72±0.12 1.34±0.23 0.96±0.08 0.77±0.14 0.80±0.08**1.37±0.22*0.81±0.15 0.54±0.02**1.25±0.10**0.44±0.08**0.32±0.10**0.59±0.07**1.01±0.14 1.17±0.12 0.47±0.11*1.88±0.28*4.40±0.06**2.91±0.14**2.57±0.10**2.76±0.08**2.32±0.05**1.39±0.12 2.93±0.13*1.94±0.09*0.96±0.17*2.50±0.06*1.50±0.18

表3 原代BMSCs 中的基因表达（±s）

表3 原代BMSCs 中的基因表达（±s）

注：与同一时间点空白对照组比较，＜0.05、**＜0.01

成骨基因 空白对照组 蛇床子素组 BMP7 组 Noggin 组 蛇床子素+BMP7 组蛇床子素+Noggin 组images/BZ_41_354_1651_402_1675.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_331_1851_354_1875.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_328_2051_354_2075.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_349_2251_374_2275.pngimages/BZ_41_382_2258_404_2282.png24 h 48 h 72 h 1.00±0.04 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.02 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.01 0.92±0.12*1.28±0.06**0.01±0.08*0.82±0.12 1.11±0.13**1.19±0.08*0.71±0.02**1.24±0.26**0.98±0.11*0.91±0.02*0.96±0.16**1.25±0.11*1.76±0.19**1.09±0.06**0.78±0.18**0.85±0.08 0.89±0.05**1.43±0.08**1.07±0.06**0.92±0.13**1.02±0.03**1.82±0.06**0.82±0.13**1.08±0.03**0.22±0.04*0.20±0.02**0.26±0.01*0.48±0.03**0.96±0.07**1.03±0.11*0.12±0.06**0.10±0.09**0.12±0.04**0.12±0.01**0.20±0.04**0.10±0.00**1.72±0.13**2.01±0.09**1.66±0.19**0.86±0.11 0.64±0.13**1.41±0.13**1.03±0.12*0.74±0.09**1.03±0.06**1.46±0.12**0.64±0.09*0.93±0.06**0.55±0.13*0.71±0.04**0.31±0.04*0.75±0.08**1.06±0.24**1.21±0.16*0.64±0.13**0.37±0.02**0.27±0.02**1.34±0.13 1.14±0.02**0.52±0.12**

综上所述，蛇床子素在BMP7 信号通路的介导下，对BMSCs 的成骨分化导具有积极的诱导作用，不仅可以促进BMSCs 成骨表达，而且在一定程度上可以改变Noggin蛋白对BMP7 成骨表达的抑制作用，这给未来临床治疗骨质疏松性骨折提供了新的研究方向。但此次研究仍有一些不足之处，本研究是在体外探讨BMP7 信号通路介导蛇床子素促进BMSCs 成骨分化的影响，但在体内BMP7 信号通路介导蛇床子素促进BMSCs 成骨分化的影响可能更为复杂，二者相互作用程度及其作用机制都还有待进一步的研究。