miR-127-5p对结直肠癌细胞增殖的影响及其作用机制*

彭 洪，彭明沙△，冯雪雅， 龚 磊

1.南充市中心医院/川北医学院第二临床学院 肛肠外科 (南充 637000)；2.南充市中心医院 胃肠外科(南充 637000)

结直肠癌是发达国家和发展中国家最主要的恶性肿瘤之一[1-2]。早期结直肠癌患者的5年生存率约为90%，但是晚期和已经发生转移的患者5年生存率仅在15%[3-4]。因此，鉴别与结直肠癌诊断、分期和预后相关的生物分子，探寻结直肠癌的发生机制具有重要意义。

MicroRNAs(miRNAs,19～25 nt)是一大类非编码RNA,在哺乳动物中可通过与靶基因3′-非编码区特异性结合发挥肿瘤调控作用。miRNA参与结直肠癌的发生发展，miR-127-5p在多个恶性肿瘤中的表达水平低，然而miR-127-5p在结直肠癌中的作用及其下游机制尚不清楚。因此，本研究检测了miR-127-5p对结直肠癌细胞增殖的影响及可能的作用机制，为结直肠癌的治疗提供了潜在的作用靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人结直肠癌细胞系(SW480、HCT116、SW620、HT29)及FHC人正常结直肠黏膜细胞购自中科院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂 miR-127-5p mimic购自广州莱博公司。NEK1、KRAS抗体及相应二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，双荧光素酶报告基因试剂盒购自江苏晶美科技有限公司，CCK-8检测试剂盒购自上海碧云天公司，NEK1过表达载体由广州莱博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR检测miR-127-5p的表达 提取经病理科证实的50例结直肠癌组织标本及配对的癌旁正常组织，使用Trizol试剂提取总RNA，逆转录为cDNA后使用PCR法检测miR-127-5p mRNA的表达。使用Trizol试剂提取SW480、HCT116、SW620、HT29、LoVo及正常结直肠黏膜细胞FHC总RNA，逆转录为cDNA后使用PCR法检测miR-127-5p mRNA的表达。miR-127-5p引物：Sequence(5′-3′)： 5′-GCCAGUCGCUUAAUAA-3′。miR-127-5p mRNA相对表达水平用2-△△Ct法进行分析。△Ct=(Ct miR-127-5p -CtU6)的平均值±标准偏差；△△Ct=(△Ct miR-127-5p -△CtU6)的平均值±标准偏差；相对样品初始模板量=(2-△△Ct)的平均值±标准偏差。

1.2.2 miR-127-5p对细胞增殖的影响 将1×105个/mL HT29细胞接种于24孔板，在100 μL培养基中加入2 μL miR-127-5p mimic，混匀，在100 μL培养基中加入加入2 μL Lipofectamine 3000，混匀，然后将稀释好的miR-127-5p mimic和Lipofectamine 3000混合并混匀，将复合物加到含有细胞和培养基的培养板孔中，设置空白对照组(Blank)及阴性对照组(NC),使用CCK-8法检测细胞增殖能力。

1.2.3 miR-127-5p靶基因的筛选和验证 使用生物信息学数据库miRBase对miR-127-5p的靶基因进行预测，选择NEK1作为目标靶基因，并用双荧光素酶报告基因法进行验证。

1.2.4 NEK1对细胞增殖的影响 构建NEK1过表达载体pcDNA3.0-NEK1质粒，在96孔板内每孔接种密度为1×105个/mL HT29细胞悬液，在25 μL的DMEM培养基中加入0.4 μg pcDNA3.0- NEK1质粒并混匀，Lipofe ctamine 3000混合，混匀后加到含有细胞和培养基的培养板孔中，设置空白对照组(Blank)及空载质粒组(pcDNA3.0)，用CCK-8法检测细胞增殖，方法如前述。

1.2.5 与NEK1相互作用蛋白的确定 从http://thebiogrid.org蛋白质相互作用数据库中查找可与NEK1相互作用的蛋白质，发现KRAS可与NEK1相互作用。

1.2.6 NEK1对KRAS表达的影响 通过pcDNA3.0-NEK1质粒上调NEK1的表达，设置阴性对照组，收集两组结直肠癌细胞，加入细胞裂解液30 min后再离心10 min(转速12 000 r/min，离心半径10 cm),取上清液测蛋白浓度后用蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)蛋白的表达。

1.2.7 miR-127-5p对KRAS表达的影响 通过miR-127-5p mimic上调miR-127-5p的表达，设置阴性对照组，Western blot检测两组HT29细胞中KRAS蛋白的表达。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 miR-127-5p在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达

通过PCR方法检测miR-127-5p mRNA在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达水平，miR-127-5p在结直肠癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织(P<0.05)(图1)。

2.2 miR-127-5p在不同结直肠癌细胞系中的表达

通过PCR法检测miR-127-5p在结直肠癌细胞株SW480、HCT116、SW620、HT29、LoVo及正常结直肠黏膜细胞FHC中的表达情况，结果发现miR-127-5p在FHC细胞株中表达量高，在LoVo细胞株中表达量低，选择中等表达的HT29细胞株用于后续研究(图2)。

2.3 过表达miR-127-5p可抑制结直肠癌细胞增殖

为观察miR-127-5p对结直肠癌细胞增殖的影响，在HT29细胞中转染miR-127-5p mimic，通过CCK-8法检测细胞增殖能力，结果发现相较于Blank及NC组，miR-127-5p mimic组中HT29细胞增殖能力明显降低(P<0.05)(表1、图3)。

表1 miR-127-5p过表达可抑制结直肠癌细胞的增殖

注：与Blank组相比较，#P<0.05

2.4 NEK1是miR-127-5p的靶基因

通过生物信息学数据库miRBase分析筛选出miR-127-5p的靶基因,miR-127-5p可与NEK1直接结合(图4)。

为了证实上述推测，构建NEK1野生型及突变型荧光素酶报告质粒并进行荧光素酶活性测定，结果表明miR-127-5p明显抑制了含有野生型NEK1报告基因的荧光素酶活性(P<0.05)而不是突变型NEK1(P>0.05),这些数据证实NEK1是miR-127-5p直接作用的靶点(图5)。

2.5 过表达NEK1可促进结直肠癌细胞的增殖

为观察NEK1对结直肠癌细胞增殖的影响，通过转染pcDNA3.0-NEK1质粒上调NEK1的表达， CCK-8法检测细胞增殖能力，结果发现与Blank及pcDNA3.0组相比，转染pcDNA3.0-NEK1后HT29细胞增殖能力明显增高(P<0.05)(表2、图6)。

表2 NEK1过表达可促进结直肠癌细胞的增殖

注：与Blank组比较，#P<0.05

2.6 与NEK1相互作用蛋白的确定

从http://thebiogrid.org蛋白质相互作用数据库中查找可与NEK1相互作用的蛋白质，发现KRAS可与NEK1相互作用(图7)。

2.7 过表达NEK1可促进结直肠癌细胞中KRAS蛋白表达

在结直肠癌HT29细胞中转染pcDNA3.0-NEK1质粒上调NEK1的表达，与阴性对照组相比，过表达NEK1可上调KRAS蛋白表达水平(P<0.05)(图8)。

2.8 过表达miR-127-5p可抑制结直肠癌细胞中KRAS蛋白表达

在结直肠癌HT29细胞中转染miR-127-5p mimic上调miR-127-5p的表达,与阴性对照组相比，过表达miR-127-5p可抑制KRAS蛋白表达水平(P<0.05)(图9)。

3 讨论

miRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。既往研究[5-7]发现，miR-127在多种恶性肿瘤(如胶质母细胞瘤、胃癌和肝癌)中表达下调，且miR-127-5p的表达水平与肝癌的组织学分级呈负相关。研究[8]证明在肝癌细胞中miR-127-5p是通过DNA甲基化进行调控的，DNA甲基化抑制剂50-aza-20脱氧胞苷可剂量依赖性诱导miR-127-5p的生成。本研究发现，miR-127-5p在结直肠癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，并且miR-127-5p在人正常结直肠黏膜FHC细胞中的表达水平高于结直肠癌细胞株，提示miR-127-5p与结直肠癌的发生发展密切相关；进一步发现过表达miR-127-5p可以抑制HT29细胞的增殖能力，证实miR-127-5p在结直肠癌的发生发展中扮演着抑癌基因的角色。

miRNA主要是通过抑制靶基因的表达在各种生物学过程中发挥作用。本研究通过生物信息学数据库对miR-127-5p的靶基因进行预测，发现NEK1可能是miR-127-5p的靶基因。进一步通过双荧光素酶法证实NEK1可与miR-127-5p靶向结合。NEK1是人类NIMA(never in mitosis gene a,NIMA)蛋白激酶家族中一个成员，最初被认定为细胞有丝分裂所必需的蛋白激酶。NIMA相关激酶除了参与有丝分裂，还具有多种细胞功能[9]。人类NIMA蛋白激酶家族包含11个NIMA相关激酶，其中NEK1和NEK4主要参与DNA损伤反应及DNA修复的信号通路[10-12]，抑制NEK1的表达可导致基因组不稳定[13]。小鼠NEK1基因的缺失可导致多囊肾病及面部畸形、侏儒、男性不育、贫血和囊性脉络丛，这些表型的多效性显示NEK1在早期发育中具有重要作用[14]。研究[15]发现在发育的后期NEK1基因突变会使人具有肌萎缩侧索硬化易感性，表明NEK1在控制疾病进展和发展中起着关键作用。除此之外，NEK1在脑胶质瘤和肾细胞癌中高表达，还可通过使电压依赖性阴离子通道蛋白1持续磷酸化抑制肾癌细胞凋亡，而下调Nek1的表达可抑制脑胶质瘤细胞增殖和增加化疗敏感性[16-17]。本研究发现在HT29细胞中过表达Nek1可促进HT29细胞增殖，这些研究结果表明Nek1是一种致癌基因。

为进一步研究NEK1促进结直肠癌增殖的作用机制，本研究通过蛋白质互作数据库查找可与NEK1相互作用的蛋白，发现KRAS蛋白可与NEK1相互作用。KRAS蛋白(最初在Kirsten大鼠肉瘤病毒中鉴定)是RAS/MAPK信号通路的一部分，其功能是通过GTPase将活性GTP转化为非活性GDP发挥开关作用，其在控制生长、成熟和细胞死亡的细胞信号转导过程中至关重要。KRAS蛋白是一种原癌基因，其由作用于转录延伸阶段的miRNA分子启动转录时与基因启动子区域结合的蛋白质所调控。研究[18-19]表明约30%的结直肠癌存在KRAS突变，其可预测肿瘤的分级及对化疗的反应。这些突变可改变KRAS的GTP酶活性，并可能激活增殖信号通路[20-21]。本研究发现过表达NEK1可上调KRAS蛋白的表达，两者呈正相关。相反，过表达miR-127-5p则可下调KRAS蛋白的表达，两者呈负相关。这些研究结果表明miR-127-5p可靶向抑制NEK1的表达，NEK1的下调则导致KRAS蛋白表达降低，使MAPK/ERK信号通路失活从而发挥抑癌作用。

综上所述，miR-127-5p作为抑癌基因在结直肠癌的发生发展中扮演着重要角色，其可通过调控NEK1/KRAS通路抑制结直肠癌细胞的增殖，有望在结直肠癌的治疗中发挥重要作用。然而miR-127-5p对结直肠癌动物模型的抑制作用及与下游靶基因和信号通路的作用机制尚需进一步的研究。