高通量测序技术在卵巢癌基因组测序应用中的研究进展*

聂 蔓，岳 军，2△

1.电子科技大学医学院(成都 610072)；2.电子科技大学附属医院·四川省人民医院 妇产科(成都 610072)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性常见的五大癌症之一，并且是导致女性死亡的第一大生殖系统癌症[1]。研究[2]表明，约有20%～25%卵巢癌的发生发展与遗传因素有关。癌症基因组研究[3]显示，96%OC肿瘤组织中都存在TP53基因突变，9%肿瘤组织中存在BRCA1基因突变，8%肿瘤组织中存在BRCA2 基因突变。OC基因组研究的突破性进展与高通量测序技术(high throughput sequencing，HTS)发展密切相关。

高通量测序技术又称为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)，能一次对几十万到几百万条 DNA 分子的序列进行测定，比第一代测序技术成本低、速度快及测序通量高[4]。根据测序目的不同，HTS主要分为全外显子测序、全基因组测序、靶向性区域测序、转录组测序等。其在肿瘤学方面的主要应用有：通过血清中肿瘤标志物的测定，协助肿瘤的诊断、预后判断及疗效评价；通过检测肿瘤患者特定的基因变异情况，协助实施针对靶点的精准治疗方案；检测正常人体中是否有肿瘤高危变异基因，对其进行及时诊断并开展早期预防性治疗[5]。肿瘤样本中基本包含正常组织，并且单个肿瘤组织中可能存在多个携带不同遗传变异类型的肿瘤亚克隆组织[6]。现对4种测序技术在OC分析中的应用情况作一综述。

1 全外显子测序

全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)是将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行测序的方法[7]。人类DNA外显子组序列约有18万个，占人类整个基因组序列的1%，约为30 Mb，但据估计85%人类致病突变均位于这1%的DNA编码序列上[8]。因此，对患者的外显子组进行测序分析，所针对的是与疾病最相关的“编码序列”区域，捕捉的是疾病的大部分致病突变信息,可用于与基因突变相关疾病的预测及诊断[9]。WES是目前针对OC基因组测序运用最为广泛的测序方法。

针对WES在高级别浆液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC)的研究，Dicks等[10]对3 107例HGSOC患者的DNA样本进行WES，确定FANCM可能为HGSOC的新型易感基因；Liu等[11]对512例HGSOC患者的DNA样本使用WES，发现发生ADAMTS基因突变患者总生存期比发生BRCA1或BRCA2基因突变患者的总生存期更长；Norris等[12]对2例HGSOC患者的肿瘤样品进行WES，结合对神经纤维蛋白NF1基因建模的结果发现由编码神经纤维蛋白的NF1基因突变引起的神经纤维瘤病1型可能与HGSOC的发生发展具有相关性；Labidi-Galy等[13]通过对9例HGSOC患者的DNA样本进行WES和拷贝数分析，发现p53印记细胞与HGSOC高度相关。

在家族性OC的研究中，Kuusisto等[14]使用WES分析来自芬兰的13个具有高风险遗传性OC家族的37个个体的生殖细胞DNA，共检测出21 530个罕见的编码功能突变及5个剪接位点突变；Stafford等[15]通过WES，对48位具有高风险遗传性OC女性的候选基因进行分析，发现了CHEK1，TP53I3，REC8，HMMR，RAD52，RAD1，POLK，POLQ和MCM4等与OC相关的突变基因；Jonson等[16]筛选了来自丹麦的1 228个具有遗传性OC的家族，通过WES，在0.5%家族的DNA中都检测到了RAD51C基因突变。

WES还可以与其他测序方法联用进行相互验证。Teer等[17]对9个非浆液性上皮性OC(包括6个卵巢子宫内膜样癌和3个卵巢黏液性癌)的DNA样本进行WES，然后将外显子组测得的数据与靶向区域性测序测得的数据相结合，共筛选出1 321个与非浆液性上皮性OC相关的基因；Lakshminarasimhan等[18]通过全基因组和WES发现ARID1a基因在卵巢癌组织细胞的DNA中经常发生突变；Kanke等[19]对22名患有OC的成年女性25～39岁进行全外显子组和RNA测序以确定其突变标记和基因图谱，发现发生突变的基因主要表现为“BRCAness”突变特征，这是BRCA1/BRCA2基因功能缺陷的一个重要指标。

2 全基因组测序

大型癌症研究组织主要使用WES技术研究癌症基因，这种方法的不足之处在于，WES只允许检测小的突变，如点突变和小的插入缺失，而全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)能鉴定大规模基因组变异，如拷贝数变异和染色体重排。WGS是通过聚合酶链式反应扩增出片段化的DNA基因组，进行最低限度处理后直接进行高通量测序。这种方法虽然操作简单却能提供全部的DNA序列信息。与其他测序方法比较，该方法占用更多计算机资源、测序时间长、数据分析成本高。WGS能覆盖几乎所有的基因组区域，并捕获包括内含子、增强子、启动子和非编码RNA的所有基因突变。这些基因调控序列通常具有重要的生物学功能[20]。WGS可以检测肿瘤基因组中所有类型的变异，包括染色体结构变异、拷贝数改变、小片段缺失和插入及点突变等。

WGS现主要用于HGSOC患者DNA的染色体突变的研究。Chien等[21]对16个早期HGSOC患者的DNA进行WGS，对早期HGSOC的发病机制提供了基因突变的证据；Vanderstichele等[22]通过WGS研究发现OC基因组中特定的碱基替换和染色体结构变异特征与基因组本身的同源重组缺陷相关；Hillman等[23]对澳大利亚80个原发性HGSOC患者的临床数据和WGS数据进行回顾性分析，在HGSOC患者DNA中鉴定出5个基因组重排特征(Ov.RS1-5)，发现具有Ov.RS3基因组重排特征的患者与具有另外4个基因组重排特征的患者相比，总体存活率较差。

散发性OC WGS研究中，Xia等[24]在研究与子宫内膜异位相关OC过程中，对64个病例的DNA样本进行WGS，发现PIK3CA、CTNNB1、ARID1A、PTEN和KRAS基因发生了突变；Itamochi等[25]对55名患有卵巢透明细胞癌(ovarian clear cell carcinoma,OCCC)的日本妇女肿瘤组织样品和匹配的血液样品DNA提取物进行WGS，发现PI3K/Akt和RTK/Ras信号通路可能是OCCC患者的潜在预后生物标志物；Patch等[26]对92例原发难治性HGSOC患者的肿瘤细胞和生殖细胞的DNA样本进行WGS，发现DNA断裂损伤会使原发性HGSOC患者基因中的肿瘤抑制子PTEN、RAD51B、NF1和RB1失活。

由于WGS数据量较大，所以研究者们会开发不同的算法程序来对测得的大数据进行分析计算。Li等[27]使用一种用于定量分析结构变异等位基因特异性拷贝数的算法Weaver，鉴定了44个OC WGS数据集中的重复发生的结构变异模式，对OC基因组固有的复杂基因组体系结构提供了更全面的评估；Jang等[28]开发出一个基于小波模型的算法程序来鉴定OC WGS数据中的焦点基因组改变，鉴定出了相关候选癌症基因及之前已知的癌症驱动基因的局部基因组改变； Schwarz等[29]利用MEDICC算法对来自14名接受铂类药物化疗的HGSOC患者的135个肿瘤分离样品的DNA进行WGS，发现瘤内异质性的定量测量指标可预测HGSOC患者经铂类药物化疗后的存活率。

3 靶向性区域测序

靶向性区域测序的目的基因片段短，测序深度高，能够有效检测到1%的低频突变，所以靶向性区域测序现广泛用于发生率较低的各类OC的研究。Mackenzie等[30]对69个黏液性OC病例里人类常见50个易突变基因进行靶向性区域测序，检测到KRAS、TP53、CDKN2A、PIK3CA、PTEN、BRAF、FGFR2、STK11、CTNNB1、SRC、SMAD4、GNA11和ERBB2基因的突变；Khattar等[31]对2例原发性卵巢淋巴癌患者的DNA样本进行靶向性区域测序，发现有4个基因在2个DNA样本中均发生了突变，分别是：CASP8、FLT3、MAP3K1和HLA-A；Arildsen等[32]对64个OCCC病例中的60个相关基因进行了靶向性区域测序，发现参与染色质重塑的基因(ARID1A、SPOP和KMT2D)在OCCC患者中经常发生突变；Rozenblum等[33]对1例高度非整倍体卵巢转移性肿瘤的DNA样本进行靶向性区域测序，在DNA样本中检测到许多单核苷酸变异，还检测到大量的焦点拷贝数变异。

由于大部分OC与BRCA1和BRCA2基因的突变相关，所以使用靶向性区域测序的方法对这2个基因及其附加基因的测序也成了近年来研究的热点。Kluska等[34]对512名患有家族OC且仅在发病早期妇女DNA样本的BRCA1/2基因进行靶向性区域测序，发现146个单核苷酸变异和32个插入缺失；Hasmad等[35]对218名来自马来西亚亚裔的浆液性OC患者的BRCA1/2基因进行靶向性区域测序，分别在8%和3%患者DNA中发现BRCA1和BRCA2基因发生了突变；De Mattos-Arruda等[36]用1例62岁BRCA1基因突变携带者的乳房、附件和盆腔-腹膜区域中的同步肿瘤块提取的DNA样品，使用包含300个已知癌症基因的平台进行靶向性区域测序，在乳房、卵巢和盆腔腹膜的DNA样品中发现的体细胞遗传性突变证实了乳腺癌和OC起源不同的说法，并且确定盆腔腹膜植入物与卵巢病变相关。

散发性OC靶向性区域测序中，Takenaka等[37]对72名日本OC患者肿瘤样品的DNA使用靶向性区域测序，检测到46个与OC相关基因中740个热点的体细胞突变和拷贝数改变，在48.6%患者的DNA样本中检测到可使肿瘤对分子靶向药物作出反应的9个基因突变和拷贝数改变；Hirotsu等[38]对155例OC患者的DNA样本进行靶向区域性测序，检测出3名患者MalevaDNA样本的ATM、MRE11A或MSH6基因发生致病性突变，且这些突变在DNA错配修复和重组修复中都起着重要作用；Maleva Kostovska等[39]对273名癌症患者和276名健康女性DNA样本的ATAD5基因进行靶向性区域测序，鉴定出22种罕见的错义替换，其中14种可被归类为致病性基因突变。

4 转录组测序

转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)能定量基因表达谱，检测新的融合基因、RNA编辑及选择性剪切变体的转录本，在OC新药的研发过程中也起到重要作用。RNA-seq能检测到DNA中相关的融合基因，并且可直接表达融合转录产物的精确序列。Smebye等[40]对19 例HGSOC患者的DNA样本进行RNA-seq，确定DPP9为HGSOC的新型融合基因候选基因；Earp等[41]对220个上皮性OC组织的DNA样本使用RNA-seq筛选融合基因，发现UBAP1-TGM7基因融合在OCCC中的发生率很高，且OCCC比HGSOC具有更多融合基因类型; Kannan等[42]对60个HGSOC患者的DNA样品使用RNA-seq结合DNA、RNA和蛋白质水平的实验验证发现，CDKN2D-WDFY2基因融合在HGSOC中的发生率为20%。

OC的RNA-seq被广泛应用于OC药物的研究上。Xu等[43]对OC细胞系A2780和耐铂紫杉醇OC细胞系A2780/PTX进行RNA-seq，发现耐药基因ABCB1、ABCB4、ABCC3和ABCG2与lncRNA上的CTD-2589M5.4基因有共表达的作用机制；Schott等[44]对使用5-FdU-Ecyd(2′-脱氧-5-氟尿嘧啶和3′-C-乙炔基胞嘧啶)处理的铂类耐药OC细胞系A2780进行RNA-seq，发现5-FdU-Ecyd可抑制肿瘤细胞的克隆和球形生长；Liu等[45]使用RNA-seq证明了天然ERβ激动剂可通过促进凋亡和抗炎症作用显著抑制OC细胞的生长，且天然ERβ激动剂可作为治疗OC的新型药物类型。

RNA-seq也广泛用于HGSOC基因测序的研究。Kreuzinger等[46]对66名HGSOC患者的新鲜冷冻肿瘤组织DNA提取物进行RNA-seq，发现B7-CD28基因在肿瘤组织中过表达；Sukhbaatar等[47]对1例HGSOC患者的DNA样本使用RNA-seq鉴定了两种功能性不同的TP53突变，发现两种不同的功能性TP53突变，一种来源于输卵管癌前病变，另一种来自卵巢病变；Bachmayr-Heyda等[48]对32名HGSOC患者的新鲜肿瘤组织和腹水中分离的肿瘤细胞的DNA样本进行RNA-seq，发现与编码RNA相比，环状RNA和lncRNA在肿瘤细胞中有更高表达且sRNA丰度不变。

5 其他测序技术

OC的发生除经典遗传因素外，表观遗传因素也参与其中。研究者针对OC基因组中甲基化的异常，对NGS作出改进，开发出了亚硫酸氢盐测序。Cui等[49]通过亚硫酸氢盐测序在OC细胞A2780和A2780cis中发现了重CpG甲基化和CCDC69基因表达的恢复；Widschwendter等[50]对151例OC患者的DNA样本进行亚硫酸氢盐测序，根据测序结果开发出了一种DNA甲基化血清标志物，此标志物可用于DNA甲基化分析，有助于OC早期发现和治疗；Häfner等[51]通过亚硫酸氢盐测序确认阵列和MSP结果，发现RUNX3和CAMK2N1基因的高甲基化可作为上皮性OC的预后指标。

微小RNA(microRNA，miRNA)是由19-23nt核苷酸所组成的单链非编码RNA，可参与到OC发生发展的多个过程。Elias等[52]将来自179例血清样品的miRNA测序与神经网络分析相结合，开发出了用于诊断上皮性OC的miRNA算法，表明循环miRNA测序结果有可能用于针对OC的非侵入性诊断检验过程； Chang等[53]使用miRNA测序鉴定出了12个非上皮性OC患者的miRNA表达谱，观察到有3个肿瘤组有显著的miRNA表达变异，表明这些miRNAs可能具有作为肿瘤标志物的潜在价值。sRNA测序(sRNA-seq)技术先对总RNA中的小RNA进行扩增，然后对扩增产物纯化后进行测序。Singh等[54]通过sRNA测序鉴定了正常卵巢与浆液性和子宫内膜样OC组织中的piRNA(与Piwi蛋白相作用的RNA)转录组，在正常卵巢、子宫内膜样和浆液性OC样品中分别检测到219、256和234个piRNA，进一步揭示了piRNA介导的影响OC发生的基因调控网络的新机制。

6 小结与展望

通过查阅近几年关于OC基因组测序的文献发现，OC新的基因突变类型发现层出不穷，且OC的突变基因的类型和频率众说纷纭。OC基因的突变不仅涉及单个基因突变，而且还涉及染色体突变、基因融合及表观遗传因素等，说明OC基因突变是一个复杂的、多因素的发生发展过程。测序过程中势必会产生大量的研究数据，而单一的测序技术本身具有一定的局限性，所以各类测序技术的联合应用在今后或成为OC基因组测序领域的主要手段。OC发病机制存在差异，而这种差异会反映在其突变谱上。因此有必要对大量OC样本进行测序，以找到更多与OC相关的基因突变。