敲除小鼠Ormdl3 基因可部分缓解降植烷诱导的狼疮表型

贾 维， 马占兵， 刘奇迹， 党 洁

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，宁夏回族自治区生殖与遗传重点实验室，银川 750004； 3.山东大学实验畸形学教育部重点实验室，济南 250001）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种临床常见的累及多系统、多脏器的高异质性自身免疫疾病，其有明显的遗传倾向，遗传度为43.6%[1]。既往研究发现，SLE 同胞患病风险是正常人的8～29 倍；SLE 同卵双生子发病率（24%～65%）远高于异卵双生子（2%～9%）[1]，提示遗传因素在SLE 发病过程具有重要作用，因此，探索SLE 发病潜在遗传学机制，筛选用于治疗SLE 的候选靶基因已成为目前研究的热点。SLE 患者体内存在多种免疫调节功能的异常，包括T、B 淋巴细胞异常反应、大量病理性自身抗体产生、补体激活和免疫复合物沉积等，其中异常的B 细胞发育分化打破机体免疫耐受，导致B细胞异常活化从而影响SLE 疾病的进程与发展，成为目前有关SLE 发生机制研究的主要方向[2]。通过对SLE 患者进行的全基因组关联研究（GWAS）显示，血清类黏蛋白样3（orosomucoidlike 3，ORMDL3）基因可能是SLE 的易感基因[3-5]。本课题组既往研究显示，ORMDL3基因在SLE 患者外周血单核细胞和Faslpr/lpr狼疮小鼠脾脏淋巴细胞中的表达增高，同时通过体内及体外实验发现ORMDL3 能够通过ATF6-内质网应激-Beclin1 自噬途径介导B 细胞自噬，通过促进B 细胞自噬和抑制B 细胞凋亡，进而促进脾脏B 淋巴细胞的过度存活，并借此在SLE 的病理发生中发挥作用[6]。

鉴于ORMDL3 对B 细胞发育及存活的影响，缺失Ormdl3 后可能会缓解狼疮小鼠的部分表型。为此，利用之前构建得到的Ormdl3 敲除小鼠，通过向野生小鼠和敲除小鼠腹腔注射降植烷（Pristane，2，6，10，14 -petramethylpentadecane，

TMPD），构建得到Ormdl3 基因敲除的降植烷诱导狼疮小鼠及其对照小鼠模型，通过对两类小鼠表型的对照研究，探讨ORMDL3 在狼疮病程发展的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采用TALEN 技术获得C57BL/6 品系Ormdl3+/-杂合敲除小鼠，通过杂合小鼠雌雄交配繁殖得到Ormdl3-/-小鼠。采用降植烷腹腔注射法诱导狼疮小鼠模型[7]。

选取6～8 周龄性别、年龄相匹配的Ormdl3-/-纯合敲除小鼠及其同窝Ormdl3+/+野生小鼠为研究对象（Faslpr/1pr小鼠模型在本文中作为阳性对照，由于Faslpr/1pr小鼠模型为自发狼疮小鼠，其与Ormdl3 敲除小鼠杂交获得双敲除小鼠的时间很长，故本文采取对Ormdl3 敲除小鼠进行降植烷诱导后获得的狼疮小鼠模型进行实验）。依据小鼠基因型不同，将Ormdl3-/-敲除小鼠及野生小鼠分为模型组和对照组。模型组小鼠单次腹腔注射0.5 mL 降植烷，对照组小鼠单次腹腔注射0.5 mL PBS 缓冲液。据此，将实验小鼠共分为4 组，Ormdl3-/-+降 植 烷 组、Ormdl3-/-+PBS 组、Ormdl3+/++降植烷组和Ormdl3+/++PBS 组，每组10只，共40 只。将全部注射后小鼠再次分为两组，即一部分在注射3 个月后处死（每组3 只），另一部分在注射6 个月后处死（每组7 只）。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 小鼠解剖器械购自上海医疗器械（集团）有限公司；冰冻切片机购自美国Thermo Scientific 科技公司；小鼠尿液收集代谢笼购自美国Hatteras instruments 公司；实时荧光定量PCR系统购自瑞士罗氏医学仪器公司；流式细胞分析仪购自美国BD 生物公司；凝胶成像分析系统购自美国Protein Simple 公司；NanoDrop 核酸与蛋白质定量分析仪购自美国Thermo Scientific 科技公司；200 目细胞筛购自上海联硕生物科技有限公司。

1.2.2 试剂 降植烷购自美国Sigma 公司；尿蛋白定量试剂盒（货号：C035-2）购自南京建成生物科技有限公司；TRIzol 购自日本Takara 公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific 公司；Real SYBR Mixture 购自北京康为世纪生物科技有限公司；5×dNTP、5×PCR 反应缓冲液、Taq 酶均购自Thermo Scientific 公司；苏木素染液、伊红染液均购于碧云天生物科技有限公司；Anti-mouse CD4 FITC、Anti-mouse CD8a PE 购自Biolegend生物科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠尿蛋白测定 采用尿蛋白定量试剂盒对待检小鼠24 h 尿蛋白进行定量分析。NanoDrop 核酸与蛋白质定量分析仪测定待测样本595 nm 处吸光度值（OD 值）。计算公式：尿蛋白浓度（mg·L-1）=（样品管OD 值-空白管OD 值）/（标准管OD 值-空白管OD 值）×标准品浓度（563 mg·L-1）。

1.3.2 HE 染色 采用常规方法制备待检小鼠脾脏组织，4 ℃沉糖，-30 ℃冰冻包埋切片，厚度为7 μm，-20 ℃保存备用。切片经解冻，苏木素染色，三蒸水终止染色、乙醇脱水（75%和95%乙醇各一次），伊红染色，三蒸水终止染色，无水乙醇二次脱水，二甲苯透明，晾干，中性树胶封片等步骤后，显微镜下观察并拍照记录。

1.3.3 脾脏单细胞悬液的制备 颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇中消毒片刻，于小鼠腹部左侧肋弓下寻找脾脏并小心钝性分离。小鼠脾脏组织通过研磨棒碾压，PBS 缓冲液冲洗，经200 目细胞筛过滤收集至15 mL 离心管中，1500 r·min-1离心10 min，弃上清。向各待测管中加入10 mL红细胞裂解液重悬细胞，室温下静置5～10 min，再次1500 r·min-1离心10 min，弃上清。加入适量PBS 缓冲液清洗并终止裂解，调节细胞密度为106～108个/mL 备用。

1.3.4 流式细胞术 吸取100 μL 小鼠脾脏单细胞悬液至无菌1.5 mL EP 管中，根据流式抗体说明书向样品管中加入适量FITC anti-mouse CD4抗体、PE anti-mouse CD8a 抗体，于室温下避光孵育20 min。1500 r·min-1离心10 min，弃上清。再次向每管中加入PBS 缓冲液冲洗2 遍，最后以500 μL PBS 缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0 软件进行统计分析，所有图像处理由GraphPad Prism 5 软件完成。组内比较采用配对t检验，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ormdl3 基因敲除小鼠的构建

利用TALEN 靶向基因敲除策略，构建得到Ormdl3 基因杂合敲除小鼠，随后通过雌雄交配获得Ormdl3 基因纯合敲除小鼠。由于ORM 家族基因同源性达92%以上，通过Western blot 法无法有效区分ORM 家族各个成员（ORMDL1、ORMLD2、ORMDL3），因此，最终采用qPCR 及半定量方法验证小鼠Ormdl3 基因敲除效率。结果显示，小鼠脾脏中Ormdl3 基因表达降低（t=4.372，P＜0.001）（图1 左）。同时，与其高度同源的Ormdl1 和Ormdl2 表达无明显改变，说明敲除效率良好（图1 右）。

2.2 小鼠注射降植烷后脾脏肿大程度、脾脏质量、体质量及其比值的变化

降植烷诱导狼疮小鼠是目前最常用的化学诱导型狼疮小鼠，一般在注射2 周后会出现淋巴细胞异常活化，6 个月后会出现尿蛋白、肾小球肾炎等严重表型。本实验结果显示所有实验小鼠脾脏在注射降植烷3 个月后都可出现不同程度的肿大，这种现象在注射6 个月后更为明显。然而，Ormdl3-/-敲除小鼠脾脏大小明显低于Ormdl3+/+野生小鼠，即使在注射降植烷后，脾脏肿大程度也明显降低，提示Ormdl3 敲除可明显抵抗脾脏肿大的现象（图2）。

通过对未注射降植烷的Ormdl3-/-敲除小鼠与Ormdl3+/+野生小鼠脾脏质量和体质量的比较结果显示，相比于Ormdl3+/+野生小鼠，Ormdl3-/-敲除小鼠脾脏质量降低（t=2.321，P=0.049），但体质量并无明显变化（t=1.071，P=0.305），因此脾质量与体质量比值降低（t=2.201，P=0.043）。注射降植烷6 个月后，Ormdl3+/+野生小鼠脾脏质量增加（t=3.770，P=0.009），而Ormdl3-/-敲除小鼠脾脏增大程度较野生小鼠变化较小（t=3.361，P=0.015）。Ormdl3-/-敲除小鼠脾脏较注射降植烷的Ormdl3+/+野生小鼠体质量改变差异无统计学意义（P＞0.05），而脾脏质量增幅降低（t=2.731，P=0.018），因此脾质量与体质量的比值降低（t=2.198，P=0.045）。以上结果进一步提示，Ormdl3 基因缺失可缓解降植烷所致小鼠脾脏免疫亢进的现象（图3）。

2.3 Ormdl3 基因敲除对降植烷诱导狼疮小鼠肾脏的影响

尿蛋白水平增高是快速直观反应SLE 患者肾脏损伤程度的有效指标，因此，为了明确Ormdl3基因敲除是否能够有效缓解降植烷诱导狼疮小鼠尿蛋白水平，利用小鼠代谢笼收集各组实验小鼠24 h 尿液，并利用考马斯亮蓝法检测尿蛋白浓度。结果显示，Ormdl3+/+野生小鼠在注射降植烷3 个月后即可检测到有尿蛋白产生，与注射6 个月后比较差异无统计学意义（t=0.464，P=0.663）。与Ormdl3+/+野生小鼠相比，Ormdl3-/-敲除小鼠在注射降植烷3、6 个月后尿蛋白浓度比较差异均无统计学意义（t=1.170，P=0.307；t=2.239，P=0.066）（图4）。

HE 染色结果显示，Ormdl3+/+野生小鼠在注射降植烷6 个月后出现明显肾小球肾炎表现，主要表现为炎性细胞浸润、肾小球体积增大致肾小囊腔减小或消失、系膜增生等。Ormdl3-/-敲除小鼠在注射降植烷6 个月后虽然也出现肾小球肾炎表现，但肾小球增大并不显著（图5）。以上结果提示，Ormdl3 基因缺失在一定程度上可以抵抗降植烷诱导狼疮小鼠肾脏损伤水平。

2.4 Ormdl3 基因敲除对降植烷诱导狼疮小鼠脾脏CD4+/CD8+ T 细胞比例的影响

SLE 患者体内往往会出现CD4+T 细胞比例升高，而CD8+T 细胞比例降低，因此SLE 患者体内是否出现免疫细胞失常通常以CD4+/CD8+T细胞比例进行判断。为了进一步证实Ormdl3 基因敲除是否会影响降植烷诱导狼疮小鼠脾脏CD4+/CD8+T细胞比例，通过流式细胞术对四组实验小鼠脾脏T 淋巴细胞比例进行分析。结果显示，Ormdl3+/++PBS 组与Ormdl3+/++降植烷组脾脏CD4+T 细胞比例差异无统计学意义（t=1.548，P=0.148）。与注射PBS 的野生小鼠比较，降植烷诱导的Ormdl3+/+野生小鼠脾脏CD8+T 细胞比例下降（t=2.250，P=0.044），进而导致CD4+/CD8+T 细胞比例升高（t=2.237，P=0.047），而敲除小鼠能够明显抵抗CD4+/CD8+T 细胞比例上升的趋势，提示缺失Ormdl3 可能抑制脾脏T 淋巴细胞的过度活化（图6）。

3 讨论

ORMDL3 作为哮喘的易感基因[8-11]，目前已经在国内外多个人群研究中得到验证[12-14]，此外越来越多的研究发现该基因还与玉型糖尿病[15-16]、炎性肠病[17]、强直性脊柱炎[18]、动脉粥样硬化[19]、SLE[6]等免疫炎症性疾病的发生密切相关。

ORMDL3 基因定位于染色体17q12-21，编码一个含有153 个氨基酸的内质网4 次跨膜蛋白，该蛋白是丝氨酸软脂酰转移酶（serine palmitoyltransferase ，SPT）在鞘磷脂生物合成初始阶段的负调节因子，其能够通过抑制SPT 的活性进而抑制鞘磷脂的合成，并可能借此抑制NK 及T 细胞免疫功能[9]。此外，作为定位于内质网膜上的跨膜蛋白，ORMDL3 还被发现能够通过抑制内质网膜钙泵活性而诱发内质网应激及未折叠蛋白反应（unfolded-proteinresponse，UPR），从而影响细胞内环境稳态，引发诸多免疫炎症性疾病的发生[20]。同时，ORMDL3 能够上调IL-17 的分泌水平，提示其可能对T 细胞的早期发育发挥重要作用[21]。

本课题组前期研究结果发现[6]，ORMDL3基因高表达于人免疫系统相关细胞系及小鼠脾脏淋巴细胞。同时，在Faslpr/1pr小鼠模型脾脏淋巴细胞中也发现ORMDL3基因表达显著增高，提示ORMDL3可能参与SLE 的病理发生。在后续构建得到的ORMDL3基因敲除小鼠中，还发现敲除小鼠脾脏体积及质量显著下降。同时，Ormdl3-/-小鼠脾脏成熟B 细胞（Mature B，CD19+IgM+IgDhi）、T2型B 细胞（Transitional 2B，CD19+IgMhiIgDhi）及腹腔B1a（B220loCD5+）细胞比例与野生小鼠相比显著下降，此结果并不受B 细胞增殖周期及凋亡水平的影响。同时，ORMDL3基因缺失对各亚型T细胞比例并无显著影响[6]。进一步研究证实，造成以上结果产生的分子机制是由于ORMDL3 能够通过促进内质网应激标记蛋白——转录活化因子6（activating transcription factor 6，ATF6）的表达和入核，导致B 淋巴细胞自噬水平提高，并抑制B 细胞凋亡，从而从整体水平上导致B 淋巴细胞过度存活[6]。

目前，B 细胞功能亢进导致自身抗体大量产生被认为是SLE 最显著的病理特征[22]，结合前期结果，ORMDL3 基因可能正是凭借其对脾脏B淋巴细胞发育及数量维持的显著调控作用，参与了SLE 等免疫炎症性疾病的病理发生。为了进一步验证ORMDL3 基因敲除是否能够抵抗狼疮病程的进展，我们利用降植烷注射构建了Ormdl3 敲除的药物诱导狼疮小鼠模型[6]。本次研究通过与野生小鼠的对比分析发现，用降植烷诱导获得的ORMDL3基因敲除的狼疮小鼠症状有所缓解，主要表现在脾脏肿大现象得到明显抑制，肾脏病理损伤程度较轻微。此外，ORMDL3基因敲除后可以明显抵抗降植烷诱导小鼠脾脏CD4+/CD8+T 细胞比例的上升。以上结果提示缺失Ormdl3 对狼疮小鼠疾病程度有所缓解，初步提示ORMDL3可能在导致SLE 发病过程中具有一定作用。

综上，本研究通过构建得到的降植烷诱导的Ormdl3 敲除狼疮小鼠表型的部分研究结果，初步提示ORMDL3 可能作为新的靶点对SLE 起到一定治疗作用。然而，本文尚存在很多不足。由于时间所限，对于ORMDL3 对降植烷诱导狼疮小鼠表型是否有缓解作用的实验结果并不充分。此外，由于小鼠遗传背景（C57BL/6）的原因，所致降植烷狼疮表型与常规诱导小鼠（BABL/c）所得SLE 表型并不完全一致，所以不能完全说明Ormdl3 对狼疮表型的影响。因此，有必要构建Ormdl3-/-Faslpr/1pr小鼠模型，希望借助自发狼疮小鼠模型对ORMDL3 是否影响SLE 发生进行更深入的研究。