Notch1 和Hes1 相关蛋白在膝关节骨性关节炎软骨组织中的表达

张 晨， 宋国瑞， 刘子歌， 陈德胜

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院骨科，银川 750004）

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以关节软骨破坏及骨质增生为主的伴有关节疼痛、肿胀、畸形及活动障碍的慢性关节疾病[1]。据估计，2020 年骨性关节炎在全世界范围内将成为第四大致残疾病[2]。KOA 的病因和发病机制目前尚未完全明确，随着研究的深入，以信号通路为靶点进行研究KOA 的发病机制成为热点。Notch 信号通路通过与靶基因Notch 1、Hes 1的结合，可以参与多种物质从细胞膜向细胞核的传递，介导如细胞生长、增殖及程序性死亡等过程[3]。本研究通过对比KOA 软骨及正常软骨组织中Notch1、Hes1 相关蛋白的表达，探讨其在骨性关节炎发生发展中的作用及其意义，拟为KOA的诊断、治疗及其预后提供新的临床思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料

标本收集自2018 年3 月1 日—2019 年2 月28 日宁夏医科大学总医院骨科，由同组手术医疗组骨科医师主刀，32 例骨性关节炎标本均经术前体征、病史、X 线影像确诊，作为病例组。其中女性20 例，男性12 例，年龄（53.32±9.22）岁；HE 染色结果通过采用改良的Mankin 评分标准[4]对关节软骨行病理分期：KOA 中期软骨组9 例；KOA 晚期软骨组23 例。全部病例术前均未接受骨性关节炎针对性治疗。对照组为16 例膝关节内骨折切开内固定术中去除的部分软骨组织，其中女性6 例，男性10 例，年龄（45.32±11.22）岁，无骨性关节炎病史。术前均经患者或家属知情，并签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

苏木素、番红O、多聚甲醛；兔抗人Notch1 单克隆抗体、兔抗人Hes1 单克隆抗体（购自美国Abcam 公司），山羊抗兔IgG（购自北京中山金桥有限公司）；DAB 显色试剂盒、PBS 缓冲液、柠檬酸盐缓冲液（购自博士德生物工程有限公司）；Image Pro Plus 6.0 图像分析软件（购自美国Media Cybernetics 公司）；H6023i 显微镜及图像采集系统（购自德国Leica 公司），CFX Connect 定量PCR 仪（购自美国BIO-RAI 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 组织处理 所有标本均截成0.5 cm ×0.3 cm×0.3 cm 的骨片，取材后经4%多聚甲醛固定、0.2 mol·L-1磷酸缓冲液中充分漂洗后置于EDTA 脱钙液中脱钙，每周更替一次脱钙液，待针刺组织而无明显阻力感时取出，冲洗24 h，将组织沿矢状面切为4 mm 组织块，脱水、包埋、切片。

1.3.2 番红染色 组织切片于70 ℃烤箱中过夜，后分别经过二甲苯脱蜡20 min 2 次，梯度乙醇脱水后，铁苏木精染色5 min，蒸馏水冲洗，1%盐酸乙醇分化30 s，蒸馏水冲洗2 min，固绿染色5min，蒸馏水漂洗30 s，番红染色5 min，蒸馏水漂洗1 min，乙酸漂洗1 min，蒸馏漂洗1 min，风干，二甲苯透明60 s，中性树脂封固，显微镜下观察。

1.3.3 HE 染色 将切片置于37 ℃恒温箱中过夜，后分别经过二甲苯玉、二甲苯Ⅱ各20 min，70%、80%、90%、95%乙醇各5 min，超纯水5 min脱蜡入水。随后在苏木素中染色2.5 min，超纯水冲洗干净，然后在1%盐酸乙醇中分化3 s 后自来水冲洗干净，ddH2O 中反蓝20 min，伊红染色3～5 s，风干后用中性树脂封固，显微镜下观察。

1.3.4 免疫组化 组织切片于70 ℃烤箱中过夜，二甲苯脱蜡20 min，脱蜡两次，梯度乙醇脱水后蒸馏水、PBS 漂洗各3 min。组织片于柠檬酸钠缓冲液中微波炉煮沸13 min，自然冷却后体积分数3%H2O2去离子水浸泡10 min，PBS 冲洗3次，分别滴加Notch 1 一抗、Hes 1 一抗，4℃冰箱孵育，8 h 后取出，PBS 冲洗3 次，滴加山羊抗兔IgG 聚合物孵育15 min，PBS 冲洗3 次，DAB 显色液显色15 s，PBS 冲洗3 次，苏木精复染5 min，蒸馏水冲洗2 次，1%盐酸乙醇分化若干秒，蒸馏水冲洗2 min 梯度乙醇复水，二甲苯透明后用中性树脂封固，显微镜下观察。

1.3.5 切片结果判定 所有切片采用双盲法由两位实验员独立阅片，进行结果评定。HE 染色结果通过Mankin 评分标准，0～3 分为正常软骨，4～11 分为中期软骨，12～14 分为晚期软骨。免疫组化结果在40 倍光镜下随机选取每张切片的5 个视野，应用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件，测评正常组、中期软骨组及晚期软骨组软骨细胞中Notch 1、Hes 1 的阳性表达率，并进行对比。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，以均数±标准差（±s）表示，多组样本均数间比较选用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KOA 软骨组织番红染色结果

对照组（16 例）：软骨基质番红染色均匀、标本表面较完整，光滑度较好，软骨细胞形态规则，胞膜完整，胞质丰富，软骨细胞数量多，潮线完整清晰（图1A）；病例组（32 例）：软骨表面不光滑，基质番红染色减退较重，软骨细胞数量重度减少、成簇分布，潮线不完整（图1B）。

2.2 KOA 软骨组织HE 染色结果

对照组（16 例）：软骨表面完整，软骨细胞较多，排列较规整，潮线规整，偶见失染现象（图2A）；病例组（32 例）：软骨面不整，细胞凋亡较多，细胞排列紊乱，软骨细胞减少，潮线中断且部分消失，染色不均且有失染现象（图2B）。按Mankin 评分标准，从软骨结构、软骨细胞数量、软骨基质染色以及潮线完整性进行评分，根据评分结果将病例组分为中期软骨组9 例、晚期软骨组23 例（表1）。

表1 KOA 软骨组织Mankin 评分（±s，分）

表1 KOA 软骨组织Mankin 评分（±s，分）

组别 n Mankin 评分对照组 16 1.68±1.06中期软骨组 9 8.47±3.39晚期软骨组 23 13.11±0.88

2.3 免疫组化检测KOA 软骨组织Notch1、Hes1表达结果

Notch1 蛋白着色区域在正常细胞内广泛分布于细胞核，细胞质内少量表达（图3A）；在病例组软骨中，可见胞质内有游离Notch1 蛋白（图3B）。Hes1 蛋白着色区域主要集中在细胞质中，呈黄色或棕色颗粒（图4A）。Hes1 主要作用于细胞外基质中的胶原纤维，在软骨细胞外基质中也存在游离的Hes1 蛋白，在病例组软骨细胞外基质中可看到颜色变化（图4B）。

Notch1 和Hes1 在对照组与病例组软骨细胞中阳性表达率见表2、表3。中期软骨组与晚期软骨组、对照组间差异均有统计学意义（P均＜0.001）；两两比较发现中期、晚期软骨组Notch1、Hes 1 阳性表达率均高于对照组（P均＜0.05），晚期组阳性表达率高于中期组（P均＜0.05）。

表2 免疫组化检测KOA 中期、晚期病例软骨Notch1 阳性细胞率比较（±s）

表2 免疫组化检测KOA 中期、晚期病例软骨Notch1 阳性细胞率比较（±s）

与对照组比较*P＜0.05，与中期软骨组比较#P＜0.05

组别 n Notch1 阳性细胞率/% F 值 P 值对照组 16 21.16±7.86中期软骨组 9 33.62±5.87* 39.660 ＜0.001晚期软骨组 23 47.12±4.33*#

表3 免疫组化检测KOA 中期、晚期病例软骨Hes1 阳性细胞率比较（±s）

表3 免疫组化检测KOA 中期、晚期病例软骨Hes1 阳性细胞率比较（±s）

与对照组比较*P＜0.05，与中期软骨组比较#P＜0.05

组别 n Hes1 阳性细胞率/% F 值 P 值对照组 16 11.56±5.92中期软骨组 9 27.42±6.27* 18.632 ＜0.001晚期软骨组 23 33.47±4.63*#

3 讨论

Sassi 等[5]提出了Notch 信号通路在KOA 中的作用，针对骨性关节炎软骨组织的研究也越来越多。Notch 信号通路是在Notch 配体与受体结合后开始激活的，即生成胞内区（Notch intracellular domain，NICD）与细胞核中DNA 结合蛋白结合后激活下游靶基因如Notch1、Hes1 相关蛋白[6]。据研究统计[7]，Notch1 蛋白的活化出现在56%～63%的骨性关节炎中，是常见的导致骨性关节炎的信号通路效应蛋白。本研究证实，Notch1 在病例组软骨组织中有阳性表达，且高于对照组。由于被异常激活后的Notch1 蛋白可以刺激巨噬细胞、炎性因子持续存在，导致骨代谢平衡能力下降，增加骨赘的形成，所以在关节畸形中发挥关键作用[8]。

Hes1 蛋白是Notch 途径的重要组成部分，是一种强碱性螺旋环螺旋转录抑制因子（bHLH），Hes1 蛋白的激活可以降解软骨基质的蛋白聚糖酶5（ADAMTS5）的血小板凝血酶敏感蛋白样序列1 区（TSP-1）及基质金属蛋白酶（MMP13）[9]。蛋白聚糖酶5 含有一个结合Hes1 的典型序列，其中包含IL-6、IL-1、IL-33 受体编码的靶基因。而IL-1 及IL-6 是诱发关节炎症和软骨退化的炎症细胞关键因子[10]。在本实验中，Hes1 蛋白在对照组及病例组软骨组织中均存在阳性表达，且晚期软骨组织中的阳性表达率要高于中期软骨组织，说明Hes1 蛋白参与了膝关节软骨磨损、退变的过程。研究表明[11]，在KOA 中，Hes1 通过抑制间充质前体细胞 （mesenchymal progen itor cells，MPCs）向软骨细胞分化，促进破骨细胞的分化成熟，增强其骨吸收活性并阻止其凋亡，骨再生能力受损，软骨组织出现不可逆性退化，甚至凋亡，出现骨性关节炎。

所以，本实验通过对Notch1 和Hes1 相关蛋白的形态学及免疫学检测，证实了其在KOA 组织中存在，且Notch1 和Hes1 蛋白的阳性表达率随着关节软骨磨损程度的加重而升高，证实其参与甚至主导了骨性关节炎中异常细胞激活和分化过程，导致骨代谢失衡、骨质破坏，正常软骨细胞炎性改变，形成KOA。在异常活化的Notch-1及Hes1 相关蛋白持续作用下，病变的骨细胞及软骨细胞无法自行修复，在后期软骨病变及骨赘的形成过程中起到关键作用[12]。综上所述，Notch1和Hes1 相关蛋白参与了KOA 的发生发展，可作为诊断膝关节骨性关节炎的参考指标之一。