乳腺肿瘤中hsa_circ_0005777 表达及其临床意义

李晓菡， 马 芳， 张 旭， 纳 莉， 田进海， 王立斌

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院，生物芯片中心，银川 750004）

乳腺癌（breast cancer）是一种女性常见的恶性肿瘤，严重危害女性健康[1]。目前临床对乳腺癌的治疗主要通过手术、放疗、化疗等方式，但患者生存率及预后效果难以保证[2]。乳腺癌生物标志物的检测对辅助临床诊断和预后判断具有重要意义，目前临床常用糖类抗原153（carbohydrate antigen 15-3，CA153）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作为乳腺癌诊断、转移及预后的生物标志物。CEA 对乳腺癌的诊断敏感性为40%，CA153 对早期乳腺癌的敏感性为60%，晚期敏感性为80%。CA153 在乳腺癌术前检测的总阳性率约为27.5%～65.9%，转移性乳腺癌的阳性率约为80%[3-4]。虽然CEA 及CA153 检测对乳腺癌临床诊断具有指导意义，但因其灵敏度低、特异度不强等原因，限制了它们的诊断价值。筛选乳腺癌的新的分子标志物，对乳腺肿瘤早期筛查及预后治疗具有重要意义。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，以共价键形成环形结构的非编码RNA 分子[5]。circRNA广泛存在于不同物种中，不仅在生物体内含量丰富，而且具有组织特异性，在组织、血液和外泌体中都有稳定表达。circRNA 能够通过调节肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成、代谢以及耐药等功能来参与肿瘤的发生、发展过程，这使得circRNA 成为肿瘤诊断、治疗和预后追踪的理想生物标志物[6]。Xuan 等[7]通过对喉鳞状细胞癌组织芯片分析，发现有698 个circRNAs 下调，其中hsa_circRNA_100855 和hsa_circRNA_104912 与 肿 瘤T3-4 阶段和分化不良有关，认为hsa_circRNA_100855 和hsa_circRNA_104912 可以作为诊断喉癌的潜在分子标志物。Li 等[8]通过分析术前和术后胃癌患者的36 对血浆样品，筛选并验证了hsa_circ_002059 与胃癌发生的关系，明确hsa_circ_002059 可作为诊断胃癌稳定分子标志物。Coscujuela 等[9]发现在乳腺肿瘤细胞MCF-7中有circRNA 的特异表达，并且这些差异表达的circRNA 可以作为区分Luminal 与其他乳腺肿瘤亚型的依据，表明circRNA 具备成为乳腺癌分子标记物和药物靶标的潜力。

本研究通过人环状RNA 表达谱芯片筛选乳腺癌癌旁组织与乳腺癌组织中差异表达的circRNA，经过显著性筛选、基因功能注释、靶基因预测、生物学功能富集和排除，确定了hsa_circ_0005777 作为研究对象，进一步研究其在乳腺癌组织和患者血液中的表达情况，分析和评价hsa_circ_0005777 与乳腺癌临床特征的相关性，探讨其在乳腺癌临床诊断中的价值，为明确hsa_circ_0005777 作为分子标志物在乳腺癌诊疗中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2016 年10 月—2017 年3 月收住于宁夏医科大学总医院肿瘤医院肿瘤外科的乳腺癌患者的术后癌组织和癌旁组织标本23 对，血液样本40 例，以40 例健康体检人群血液样本作为对照。研究过程获得宁夏医科大学总医院医学伦理委员会批准，所有患者或其家属均签署知情同意书。患者纳入标准为：（1）女性；（2）乳腺癌的病理诊断；（3）无既往癌症病史；（4）无艾滋/艾滋病病毒感染；（5）接受乳房切除术；（6）患者术前均无放疗或化疗史；（7）无合并其他肿瘤；（8）临床信息完整。

1.2 样本及临床信息采集

收集乳房切除术后乳腺癌病变和离肿瘤边缘＞5 cm 处正常组织，置于液氮中，立即转入实验室提取RNA。收集所有患者基本信息、临床特征、入院检验结果等，包括：（1）基本信息：患者的年龄、性别、住院号、手术时间和方式等，其中患者年龄34～67 岁，平均（50.9±8.1）岁；（2）患者病理诊断和分型；（3）患者的临床特征：肿瘤大小、是否转移、肿瘤TNM 分期、雌激素受体（estrogen receptor，ER）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、原癌基因人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）、抗原Ki-67 等临床指标，依据美国癌症联合委员会对恶性肿瘤分期系统的分类确定患者的肿瘤分期[10]；（4）血清检验结果：血常规、糖类抗原125（CA125）、CA153、糖类抗原199（CA199）、CEA 等肿瘤标志物指标。

1.3 RNA 提取及反转录

使用TRIzol 法（美国Thermo Fisher Scientifc 公司）从组织中提取总RNA，然后通过GoScript 反转录（RT）系统（美国Promega 公司）将RNA 反转录为cDNA。使用外周血液样品的总RNA 快速提取试剂盒（中国Bioteke 公司）从血液中提取总RNA并通过GoScript 反转录（RT）系统将RNA反转录为cDNA。反转录体系为：1μL 总RNA（约500 ng），1μL random primer，10 μL ddH2O，2 μL dNTP，4 μL反转录buffer，1 μL RNA 酶抑制剂，1 μL 反转录酶，总体积20 μL；反应条件为：25℃5 min；42℃60 min，70℃5 min。RNA 及cDNA 置于-80℃贮存备用。

1.4 circRNA 芯片分析

选取三对乳腺癌和癌旁组织样品RNA，利用人circRNA 表达谱芯片（Human cirRNA array rersion2.0，北京博奥生物有限公司）检测样品中circRNA 表达情况，该芯片覆盖162351 条已知circRNA 的探针。应用Feature Extraction 软件（北京博奥生物有限公司）提取芯片数据，Cluster 3.0 软件进行聚类分析，GeneSpring13.0（安捷伦科技有限公司）分析差异倍数（fold change，FC）、荧光值等。初步过滤和质控去除检测结果中不达标部分，剩余数据进行筛选，筛选条件：FC≥4，P＜0.05，荧光值≥100。

1.5 qRT-PCR 检测hsa_circ_0005777 在乳腺癌组织及癌旁组织的水平表达差异

将提取好的乳腺癌组织和血液样本的cDNA使用LightCycler480II 定量平台（美国Roche 公司）以β-actin 为内参进行实时荧光定量PCR 实验（qRT-PCR）。hsa_circ_0005777 引物：Forward-CA TCTAAAGAAAAGAAGGTTGGTGA，Reverse-GGC TGGTAGTGGCAGTGATT；β-actin 引物： Forward-CCACGGCTGCTTCCAGCTCC，Reverse-GGACTCCATGCCCAGGAAGGAA。反应体系为：以2 μL cDNA 作为模板，分别加入上、下游引物各0.8 μL，6.4 μL ddH2O 和10 μL SYBR MIX，总体积20 μL；qRT-PCR 条件为：在95 ℃下初始变性步骤10 min；然后在95 ℃下进行40 个循环15 s，60℃30 s，95 ℃5s，65 ℃2 min，在0.11 ℃/s 下升温至97 ℃以测量荧光信号。记录hsa_circ_0005777 和β-actin 的循环阈值（Ct）值。通过2-ΔΔCt方法分析计算基因的相对表达量[11]。所有样品进行3 次重复实验。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验以及单因素方差分析；计数资料采用双变量Spearman 相关性检验；对单项及联合检测结果作图绘制成ROC 曲线，计算曲线下面积（AUC）。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中的circRNA 表达谱芯片分析

乳腺癌及癌旁组织间存在大量差异表达的circRNA（图1A、B）。通过筛选，并进行肿瘤的相关性预测后，选择在乳腺癌中显著下调的hsa_circ_0005777 作为研究目标，其序列具有特异性（图1C）。

2.2 hsa_circ_0005777 在乳腺癌中的表达

通过qRT-PCR 测定hsa_circ_0005777 在23对乳腺癌组织及癌旁组织中的相对表达，验证筛选结果。结果显示，与癌旁组织相比，hsa_circ_0005777 在乳腺癌组织中表达下调（P＜0.01），下调倍数约为4.683 倍（图2A）。ROC 曲线分析结果显示，hsa_circ_0005777 在23 对乳腺癌患者组织中的AUC 为0.983（P＜0.01），截断值为12.07，灵敏度为95.7%，特异度为95.7%（图2B）。hsa_circ_0005777 与CEA 协同诊断乳腺癌的AUC 为0.952（P＜0.05），截断值为12.38，灵敏度为90.5%，特异度为100%（图2C）。

2.3 hsa_circ_0005777 的表达与乳腺癌患者临床病理指标的关系

hsa_circ_0005777 乳腺癌组织circRNA 检测值在CEA、肿瘤是否转移、PR、Ki-67、TNM 分期、临床早晚分期等临床指标中差异均有统计学意义（P均＜0.05），在肿瘤大小、CA153、HER2、ER、AR、病理类型中差异均无统计学意义（P均＞0.05）（表1）。

2.4 hsa_circ_0005777 与乳腺癌中临床病理指标的相关性分析

hsa_circ_0005777 与CEA 表达呈负相关（r=-0.466，P=0.025）。

表1 hsa_circ_0005777 在乳腺癌不同临床病理指标中的分布（±s）

表1 hsa_circ_0005777 在乳腺癌不同临床病理指标中的分布（±s）

注：CA153 阳性的界限值为25 U·mL-1；CEA 阳性的界限值为5.2 ng·mL-1

临床病理指标 n 癌组织circRNA 检测值 t/F 值 P 值CA153 1.103 0.282阳性 2 14.21000±1.11723阴性 21 13.40900±0.97378 CEA -2.388 0.026阳性 2 12.03500±1.05359阴性 21 13.61620±0.88625肿瘤大小/cm 0.689 0.499＜2 14 13.32640±0.76085≥2 9 13.71560±1.27620肿瘤是否转移 2.813 0.010是12 13.96170±0.95665否11 12.95180±0.73924 HER2 -0.898 0.380阳性 13 13.31620±1.05563阴性 10 13.69000±0.89581 ER 0.330 0.745阳性 20 13.50550±1.04627阴性 3 13.30000±0.48754 PR 2.513 0.020阳性 13 13.88540±0.98872阴性 10 12.95000±0.72329 AR 0.433 0.670阳性 21 13.50670±1.01979阴性 2 13.18500±0.62933 Ki-67/% 2.845 0.010＜14 9 12.84440±1.05652≥14 14 13.88640±0.70747 TNM 分期 3.698 0.043 I 8 13.25250±0.67875 II 9 13.12110±0.99462 III 6 14.31670±0.94574临床分期 -2.281 0.033早期（I-II） 17 13.25220±0.86368中晚期（III-IV） 6 14.29400±1.05555病理类型 1.272 0.302非浸润性癌 4 12.77750±1.08312浸润性特殊型癌 2 13.64060±0.92669浸润性非特殊型癌 17 13.50500±1.30815

2.5 hsa_circ_0005777 作为乳腺癌分期分型的临床标志物研究

hsa_circ_0005777 诊断乳腺癌Luminal 分型、HER2、ER、PR、AR 阳性以及乳腺癌早晚分期，AUC 分别为0.518、0.600、0.567、0.568、0.596、0.789（P＞0.05）（图3A～F）；hsa_circ_0005777 诊断Ki-67 阳性率的灵敏度为85.7%，特异度为77.8%（AUC=0.817，P=0.012，截断值=13.38）（图3G）；hsa_circ_0005777 诊断乳腺癌是否转移的灵敏度为75.0%，特异度为81.8%（AUC=0.795，P=0.016，截断值=13.54）（图3H）。

2.6 hsa_circ_0005777 在乳腺癌患者血液中的表达

通过qRT-PCR 法测定hsa_circ_0005777 在健康人群血液和乳腺癌患者血液中的表达。结果显示，与健康人群相比，hsa_circ_0005777 在乳腺癌患者的外周血中表达下降（图4A）。基于ROC曲线分析，hsa_circ_0005777 的AUC 为0.835（P＜0.01），截断值为14.43，灵敏度为80.0%，特异度为72.5%（图4B）。

3 讨论

circRNAs 是一类特殊的非编码RNA，广泛存在于生物体内，不易被核酸外切酶降解，与线性RNA 相比能更稳定地存在于生物体内[12]。circRNA 不仅含量丰富，而且在不同组织及发育阶段都有特异性表达，这使得circRNA 成为疾病诊断、治疗和预后追踪的理想生物标志物[13]。研究证实，circRNAs 与不同肿瘤的发生紧密相关，在乳腺肿瘤研究中，Lü 等[14]报道hsa_circ_103110、hsa_circ_104689 和hsa_circ_104821 在乳腺癌组织中表达水平升高，而hsa_circ_006054、hsa_circ_100219 和hsa_circ_406697 在乳腺癌组织中低表达，说明在乳腺肿瘤发生过程中，存在差异性表达的circRNA。Nair 等[15]通过Circ-Seq 筛查乳腺癌和癌旁组织中circRNA 表达，发现雌激素受体阳性（ER+）亚型中的circRNA 数量与增殖基因的复发风险评分呈负相关，提示circRNA 可能与乳腺细胞增殖复发有关。Yin 等[16]从5 例乳腺癌和配对的健康志愿者血浆样本中筛选差异表达的circRNA，通过q-RT-PCR 验证候选circRNA 的表达，发现hsa_circ_0001785 与肿瘤患者TNM 分期和远处转移密切相关，且比其他circRNA 具有更好的诊断价值，由此确定血液hsa_circ_0001785可作为乳腺肿瘤患者诊断的潜在生物标志物。

hsa_circ_0005777 定位于人类5 号染色体正义链73136304-73136585 区域，全长281bp，由ARHGEF28 基因外显子（exon）11 区剪切环化而成。hsa_circ_0005777 最早由Jeck 等[17]在男性正常龟头细胞（HS68）中发现，验证其为环状RNA，并且在体内比相关的线性mRNA 更稳定。研究表明，hsa_circ_0005777 的靶基因ARHGEF28（Rgnef）可以通过与黏着斑激酶的相互作用促进结肠肿瘤增殖，推测hsa_circ_0005777 可能与结肠癌的发生、发展有关[18]。但目前尚未见到有关hsa_circ_0005777 与乳腺肿瘤的文献报道，本研究首次报道hsa_circ_0005777 与乳腺癌的临床特征相关性及其临床诊断价值。

本研究中，首先选取乳腺癌和癌旁组织进行circRNA 芯片分析，通过对芯片检测结果的聚类分析及差异化筛选，并进行肿瘤的相关性预测后，选择在乳腺癌组织中下调的hsa_circ_0005777作为研究目标。扩大样本量进行qRT-PCR 验证结果显示，与癌旁组织比较，hsa_circ_0005777 在23对乳腺癌组织中表达下调。 hsa_circ_0005777 诊断乳腺癌早期诊断的灵敏度为95.7%，特异度为95.7%，AUC 为0.983，截断值为12.07。乳腺癌患者中CEA 与CA153 的联用可以增加监测乳腺癌诊断的灵敏度[19]，而hsa_circ_0005777 与CEA 水平相关可说明其作为新的肿瘤标志物的可能性，提高临床检出率。将hsa_circ_0005777 与CEA 进行协同ROC 曲线分析，发现联合诊断能够明显提升诊断的特异度。因此，hsa_circ_0005777 与CEA 的联合检测可为乳腺癌的早期诊断及筛查提供更加可靠的依据，为乳腺癌患者赢得更多的生存机会。

本研究发现hsa_circ_0005777 与CEA 呈负相关，并且发现其在乳腺癌转移的诊断中具有一定的灵敏度和特异度。说明hsa_circ_0005777 对乳腺癌术后复发转移有一定的预测意义，可避免影像学检查可能出现的漏诊情况，从而作为乳腺癌转移的辅助诊断指标，这与Valenzuela等[20]报道结果一致，表明hsa_circ_0005777 与乳腺癌的扩散有密切关系。ER、PR 的检测有利于治疗方案的选择，只有受体阳性才适合内分泌治疗，而hsa_circ_0005777 与PR 阳性水平相关，提示其可作为乳腺癌分型的辅助诊断。Ki-67 在静息细胞中的缺失和分裂细胞中的广泛存在使其成为细胞增殖的标志物，与证实其与乳腺癌的恶性程度呈正相关[21]。本研究通过ROC 曲线分析hsa_circ_0005777 与Ki-67 对乳腺肿瘤转移诊断的灵敏度和特异度，提示hsa_circ_0005777 可能与乳腺肿瘤的增殖、侵袭和迁移能力密切相关，对乳腺癌的诊断及预后的判断有着重要的参考价值。

综上所述，hsa_circ_0005777 在乳腺肿瘤患者组织和血液中低表达，并与乳腺肿瘤病理分期、分型以及肿瘤增殖和淋巴结转移相关性较大，可以作为评估乳腺肿瘤发生的一个潜在的生物标志物。