缺血性脑卒中患者24 h 尿液氨基酸水平的研究

王斌霞， 刘秀英， 李小霞， 刘婉露， 赵 燚， 张毓洪

（宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004）

脑卒中已成为我国首位死因，其发病率、死亡率、致残率高，并发症多，且发病趋于年轻化[1-2]。缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）作为卒中的主要类型，约占总卒中的87%[3]，我国IS 的患病率和发病率分别占总卒中69.6%和77.8%[4]。因此，应对其高度重视并及早预防。近年来，国内外诸多学者已对脑卒中进行非靶向代谢组学研究，发现患者体内存在能量、糖类、脂类和氨基酸代谢异常[5-7]。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，人体内氨基酸在正常生理状态下处于动态平衡，病理状态时出现失衡[8]。多项研究均表明脑卒中患者体内存在氨基酸代谢紊乱[9-12]。既往研究资料主要来源于医院的住院患者和健康体检者的血液，而缺乏自然人群中IS 患者24 h 尿液氨基酸的研究。尿液作为代谢的终产物，可反映机体的代谢情况，较血浆更易获取，且24 h 尿液代谢物浓度不受采样时间和日变化的影响，是一种理想的检测样本[13-15]。因此，本研究从氨基酸代谢角度出发，分析IS 和24 h 尿液氨基酸的关系，探讨与IS 发生相关的代谢物，以期为其发病机制研究提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究选择宁夏青铜峡市和平罗县作为调查现场，IS 患者来源于低钠盐与脑卒中的关系研究项目[16]。该项目从青铜峡市及平罗县两个地区的80～120 个行政村中，随机选择60 个村，共计120 个村，每个村按照诊断、纳入和排除标准选择35～40 名研究对象。分别于2016 年2 月、2017年2 月进行随访，每个地区随机抽取16 个村，共计32 个村，每村中随机选择20 名研究对象。根据年龄、性别成组匹配的原则在病例组所在村纳入相应的对照。对研究对象进行24 h 尿液收集。本次研究收集IS 患者286 例，排除有心脑血管疾病及糖尿病等慢性病者、重复测量及实验数据缺失者130 例，共156 例进入研究；对照组301例，经排除后，共280 例进入研究。该研究通过了宁夏医科大学伦理委员会的批准（批准编号：2013-175），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 诊断、纳入及排除标准

1.2.1 诊断标准 IS 患者均符合第四届全国脑血管病学术会议修订的“各类脑血管病的诊断要点”中的诊断标准[17]。

1.2.2 纳入标准 IS 组：既往有缺血性脑卒中史（具有县级及以上医院出具的诊断证明），且年龄在35 岁及以上者；对照组：既往无高血压、脑卒中病史，现场两次血压值测量收缩压≤140 mmHg和（或）舒张压≤90 mmHg，且年龄、性别及居住地与IS 患者成组匹配者。

1.2.3 排除标准 既往短暂性脑缺血发作及其他脑部疾病患者；有心脏病、糖尿病病史者；丧失基本行动能力者；严重感染、自身免疫性疾病、急慢性肾脏疾病及肿瘤患者；酒精或药物滥用史者；24 h 尿液收集不符者（尿液遗漏量超过总尿量的10%者；晨尿遗漏者；尿液被血、大便或分泌物等其他杂质污染者；留尿期间出现大汗、恶心、呕吐、腹泻等情况者；急慢性尿道感染者）及实验检测数据缺失者。

1.2.4 吸烟判定标准 吸烟史[18]：平均每天至少吸1 支烟，并且连续吸烟＞1 年；现在吸烟：有吸烟史，并且在过去30 d，平均每天吸烟≥1 支者。

1.3 方法

调查工作由经过统一培训的具有医学背景的人员进行，收集研究对象的一般人口学特征、健康相关行为、慢病史等，并对其进行体格检查、血压测量以及24 h 尿液收集。尿液标本在低温条件下运输至宁夏医科大学公共卫生与管理学院实验中心于-80 ℃贮存待用。采用日立L-8900全自动氨基酸萃取分析仪进行24 h 尿液中氨基酸水平的测定。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料满足正态分布者采用均数±标准差（±s）表示，不满足正态分布则以中位数和四分位数间距［M（P25，P75）］表示，组间比较采用t检验或Mann-Whitney U 检验；计数资料采用率或构成比表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman 相关对氨基酸代谢物及身体测量指标间的相关性进行分析，以热图表示；采用多因素调整Logistic 回归分析与IS 发生相关的氨基酸代谢物。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 研究人群基本特征

纳入的436 例研究对象中，男性238 例，女性198 例，平均年龄（62.6±7.6）岁，平均体质量指数（BMI）为（23.8±3.5）kg·m-2。IS 组与对照组人群性别、现在吸烟比例、学历及年龄差异均无统计学意义（P均＞0.05）；IS 组患者吸烟史的比例、体质量、收缩压及舒张压均高于对照组，身高低于对照组（P均＜0.05），见表1。

2.2 24 h 尿液中氨基酸水平

通过测定，对照组及IS 组人群24 h 尿液中均测出以下14 种氨基酸：丝氨酸（Serine，Ser）、谷氨酸（Glutamic acid，Glu）、甘氨酸（Glycine，Gly）、丙氨酸（Alanine，Ala）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）、缬氨酸（Valine，Val）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、异亮氨酸（Isoleucine，Ile）、亮氨酸（Leucine，Leu）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、组氨酸（Histidine，His）、色氨酸（Tryptophan，Trp）、精氨酸（Arginine，Arg）。而天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、苏氨酸（Threonine，Thr，）及脯氨酸（Proline，Pro）仅在少数研究对象尿液中测出，所以不予以分析。

由表2 可见，IS 组患者Cys、Val、Ile、Leu、支链氨基酸（BCAAs）及支链氨基酸/芳香族氨基酸（BCAAs/AAAs）水平均高于对照组（P均＜0.05），其他氨基酸在两组间差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表1 研究对象基本特征

表2 对照组与IS 组人群24 h 尿液中氨基酸水平比较（mg·L-1）

2.3 各氨基酸代谢物与身体测量指标的关系

如图1 所示，除BCAAs/AAAs 与各氨基酸间存在负相关外，其他各氨基酸指标之间均存在正相关，其中Ser、Ala、Cys、Val、Leu、Tyr、Trp、BCAAs、AAAs 之间相关系数达0.8 以上；同时，各氨基酸与SBP、DBP、BMI 也存在弱相关。

2.4 IS 发生的Logistic 回归分析

将14 种氨基酸代谢物及组合指标进行二分类条件Logistic 回归分析，结果显示未调整任何变量时（Model 1），Ser、Cys、Tyr、Arg 进入模型；在调整年龄、性别、吸烟史、现在吸烟及学历后（Model 2），Ser、Cys、Arg 进入模型；进一步调整身高、体质量（Model 3），结果未变，见表3。

将研究人群按这些氨基酸的四分位水平进行分组，调整年龄、性别、吸烟史、现在吸烟、学历、身高及体质量后，Logistic 回归分析结果显示Ser、Cys 最高四分位数患者IS 的危险分别是最低四分位数的0.086 倍、10.556 倍，见图2。

3 讨论

表3 氨基酸代谢物的Logistic 回归分析

氨基酸作为蛋白质合成的基质，其代谢平衡对维持机体健康至关重要[8]。研究表明，BCAAs在大脑中发挥着独特的调节作用，它们是星形胶质细胞和神经元Glu/谷氨酰胺循环的组成部分，在兴奋神经元信号中对Glu 的有效摄取起重要作用[19]。本研究结果显示，IS 患者24 h 尿液中BCAAs 较对照组升高。Kimberly 等[9]观察发现，急性脑卒中大鼠血浆、脑脊液及患者血浆中BCAAs水平下降，并且其下降程度与不良神经结局有关。Jung 等[20]发现脑梗死患者血浆中Val、Glu 水平降低，Ile、Leu 水平未变，尿液中Gly 水平降低；脑卒中或卒中后认知功能损害人群血浆中Tyr 升高，Val、Ile、Trp 水平降低[21]。以上结果均与本研究不一致。因此，关于BCAAs 在IS 患者尿液中的代谢需要更进一步探索。

热图相关性分析证实，多种氨基酸间存在密切联系，与既往研究结果一致[9]。此外，本研究显示氨基酸代谢物与血压之间也存在相关性。有文献报道[22]，青少年摄入BCAAs 对SBP、DBP 无影响。600 名农村体检居民的血清Val、Ile、BCAAs与SBP、DBP 均呈正相关[23]。朱晓伟等[24]认为高血压患者尿液中氨基酸与血压呈负相关。由此可见，氨基酸代谢物与血压之间存在一定的联系。

氨基酸具有多种生理功能，它们的变化可能反映了脑卒中的一些病理生理学途径。一些氨基酸，如BCAAs、Ser 可作为信号分子，调节各种必需的细胞过程，如维持生长和修复大脑功能损伤[25]。赖氨酸（Lysine，Lys）和Arg 是两种基本氨基酸，给实验大鼠口服Lys 和Arg，发现抑制Glu 引起的神经元活动可能与Lys 和Arg 的神经保护作用有关[26]。此外，Arg 是NO 的前体和有效的血管扩张器，可降低脑梗死面积[27]。Cys 可通过减少氧化应激、改善胰岛素抵抗和葡萄糖代谢、降低高级糖化终产物、调节NO 及其他血管活性分子水平，直接或通过其储存形式谷胱甘肽发挥降压作用[28]，同时膳食研究表明Cys 的摄入与脑卒中的发生呈负相关[29]。

综上，本研究通过探索IS 患者24 h 尿液中氨基酸代谢变化，建立了由Ser、Cys 组成的新型尿液代谢物组，这可能有利于IS 发病机制的明确。本研究为横断面研究，未能明确判断其时间先后顺序；同时关于此代谢物组能否作为新型代谢物的普适性，需在大样本人群中使用时间序列动态监测去验证，从而为早期的诊断或治疗提供基础。