Piezo2 在结直肠癌中的表达及临床意义

陈 托， 张立杰， 张丽君， 荣诗阔， 王 振， 彭根远， 巩发海， 李 海

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院结直肠外科，银川 750004；3.济宁医学院附属医院兖州院区呼吸内科，济宁 272000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一。在我国，结直肠癌居全国恶性肿瘤发病的第四位，并呈逐年上升的趋势[1-2]。Piezo2 基因家族可通过机械信号转导过程激活下游信号转导途径，在肿瘤的侵袭与转移中发挥作用[3]，推测Piezo2 可能参与了结直肠癌的进展和转移。本实验通过实时荧光定量PCR（q-PCR）及免疫组织化学染色方法检测结直肠癌及癌旁组织中Piezo2 的mRNA 和蛋白的表达，分析其与结直肠癌临床病理特征的关系，以探讨Piezo2 在结直肠癌中发挥的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

标本来源于2015 年10 月至2017 年3 月在宁夏医科大学总医院行结直肠外科手术的结直肠癌患者113 例，术后均经病理科确诊。获取结直肠癌标本113 份，同时取该标本相对应的癌旁组织（距离癌组织中心＞5 cm）。所有患者术前均未进行放疗、化疗，年龄32～78 岁，平均（53.00±12.27）岁；男64 例，女49 例；直肠癌62 例，结肠癌51 例。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol（Invitrogen，货号：15596-026）、反转录cDNA 试剂盒（Thermo Fisher，货号：00118088）、SYBRRSelect Master Mix（Thermo Fisher，货号：4472908）；鼠抗人Piezo2 多克隆抗体（abcam，货号ab81327）、超敏二步法试剂盒（北京中杉金桥，货号：P6001）、DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥，货号：ZL1-9018）；Bio-rad IQ5 仪器等。

1.3 方法

1.3.1 q-PCR 实验 研磨结直肠癌及癌旁组织后加入Trizol 裂解液充分裂解，氯仿分离RNA，等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，弃上清液，75%乙醇清洗RNA 沉淀，混匀后离心，加入适量DEPC 水溶解沉淀。然后酶标仪检测260 nm 和280 nm 处的OD 值，测定RNA 溶液浓度和纯度。20 μL 体系加样后在Bio-Rad 仪器上上机检测（50℃预热2 min，95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火及延伸1 min，共40 个循环）。其中Piezo2 引物：上游5'CGGAATTCATGGCCTCAGAAGTGGTGTGC 3'；下游5'CGGGATCCT CAATTTGTTTTTTCTCTAGTCCATTTGATCATTGT CTCT3' ；内参GADPH 引物：5'ACATCAAGAAGG TGGTGAAGCAG3'，5' GTCAAAGGTGGAGGAGTG GGT3'。

1.3.2 免疫组织化学法（IHC） 石蜡包埋固定，切片，烤片3 h 脱蜡、脱水，柠檬酸盐高压修复后3% H2O2室温孵育以消除内源性过氧化物酶的活性，10%正常山羊血清封闭后滴加一抗Piezo2（1：300）工作液，4℃下孵育过夜，抗鼠二抗孵育1 h，苏木素染色、盐酸酒精分化、清水反蓝，脱水、二甲苯透明后中性树胶封片，于Leica 正置显微镜下观察并拍照，使用GraphPad 6.0 软件统计作图。

1.4 判定标准

1.4.1 q-PCR 法结果判定 采用2-△△Ct分析Ct值计算结果：△△Ct=癌组（Ct-Ct 空白）-癌旁组（Ct-Ct 空白）。

1.4.2 IHC 法结果判定[4]直肠癌组织中Piezo2主要表达在细胞膜上，由病理科医师在100 倍镜下随机观察10 个视野，根据着色强度和阳性细胞数分别计分。染色强度：阴性（-）：无染色，0分；弱（+）：淡黄色，1 分；中（++）：棕黄色，2 分；强（+++）：棕褐色，3 分。IHC 染色后细胞数评分标准：染色细胞数占同类型细胞数的百分比＜30%为1 分，30%～60%为2 分，＞60%为3 分。着色强度和阳性细胞数计分之和≥4 分视为Piezo2蛋白表达阳性；＜4 分为Piezo2 蛋白表达阴性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌和癌旁组织中Piezo2 mRNA 表达情况

癌组织中Piezo2mRNA 相对表达倍数高于癌旁组织（P＜0.01），见图1。

2.2 结直肠癌和癌旁组织中Piezo2 蛋白表达情况

IHC 实验结果显示，在结直肠癌组织中Piezo2主要表达在细胞膜上，染色为棕褐色，呈强阳性表达；在癌旁组织中，Piezo2 呈弱阳性或阴性表达。Piezo2 在结直肠癌组织的阳性表达率（68.14%）高于癌旁组织（16.81%）（P＜0.01），见图2。

2.3 不同临床特征结直肠癌组织中Piezo2 蛋白表达比较

结直肠癌组织中Piezo2 阳性表达率随分化程度增高而降低（P＜0.01），TNM 分期为（玉+Ⅱ）期的结直肠癌组织中Piezo2 阳性表达率低于（Ⅲ+Ⅳ）期者（P＜0.01），有淋巴结转移的结直肠癌组织中Piezo2 阳性表达率高于无淋巴结转移者（P＜0.01）；不同年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小、部位的结直肠癌组织中Piezo2 阳性表达率差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1 不同临床特征的结直肠癌组织中Piezo2 蛋白表达比较

3 讨论

Piezo 蛋白是一类机械敏感性离子通道，包括Piezo1 和Piezo2[5-6]，是通过感受细胞膜表面应力变化，实现胞外机械信号向胞内转导的通道[7-9]。体内研究表明，当上皮细胞变得过于拥挤时，激活Piezo1 通道以挤压触发细胞[10]，直至细胞死亡，以保持屏障功能并防止肿瘤形成[11]。同时还发现Piezo1 可以提供机械力和细胞内生化途径激活之间的联系结合促进胃癌的转移[12]，亦可促成膀胱癌的癌变[13]。Piezo 作为直接机械活化的离子通道，在癌症发展中将肿瘤微环境的机械特性紧密地联系在一起。

Piezo2 蛋白是一类复杂的跨膜蛋白[8]，其在肠上皮细胞的功能中发挥作用[14]。研究证实，Piezo2 可作为重要的机械力传感器感受机械刺激并将其转化为电信号，参与轻触觉、本体感觉、机械性痛觉超敏、血管内皮细胞的重排和血管发育[3，9，14-18]。然而，Piezo2 在机械刺激下可诱发Ca2+内流而激活下游信号通路，通过一系列的复杂信号级联反应来促进肿瘤血管的生成，并加快细胞迁移及肿瘤发展，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，引起如细胞增殖、血管通透性增加、血管生成、肌动蛋白重组以及迁移等反应[3，19]。同时，Piezo2 在多种疾病中如结肠炎、乳腺癌、喉鳞状细胞癌、胃癌、膀胱癌、胶质瘤等均高表

达[3，13，19-22]。

本研究结果显示，在结直肠癌组织中Piezo2 mRNA 及蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织，表明Piezo2 在结直肠癌的发生中起着重要作用。为了进一步证实Piezo2 在结直肠癌中的作用，通过分析不同临床特征结直肠癌组织中Piezo2 蛋白表达，发现不同分化程度的结直肠癌组织中Piezo2 的阳性表达率随分化程度增高而降低，且TNM 分期（玉+Ⅱ）期的Piezo2 阳性表达率低于（Ⅲ+Ⅳ）期。同时，有淋巴结转移的结直肠癌组织中Piezo2 阳性表达率高于无淋巴结转移者，提示Piezo2 蛋白表达与结直肠癌的侵袭和转移密切相关。

综上，Piezo2 蛋白参与了结直肠癌的发生、发展，此研究可能为结直肠癌患者分子水平治疗提供新的思路与靶点，其具体机制及临床应用有待进一步研究。