胡小东, 关 浩, 杨立山
(1.宁夏医科大学,银川 750004; 2.宁夏医科大学总医院急诊科,银川 750004)
急性CO中毒迟发性脑病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)是急性CO 中毒最严重的神经系统并发症,约3%~30%的严重CO 中毒患者经过2~60 d 的假愈期后出现迟发性脑病[1],其确切发病机制迄今尚未阐明,无特效的治疗手段,给社会和家庭带来沉重的负担。筛选合格DEACMP 模型是验证造模成功与否的基础,是探索其发病机制的前提,对预判DEACMP 易发时间段提供一定的依据,对指导下一步治疗有重要应用价值。本实验采用连续腹腔注射CO 染毒的方式造模,在造模前后6 个时间筛选点,先通过Morris 水迷宫定位航行实验的平均潜伏期检测DEACMP 大鼠认知功能,初步筛选出DEACMP 大鼠模型,再通过组织形态学技术观察海马神经元变性坏死情况,将变性坏死的神经元计为“阳性细胞”,对平均潜伏期和阳性细胞进行相关性分析,探索Morris 水迷宫在连续筛选DEACMP 模型方面的应用价值。
选择健康成年雄性SD 大鼠,体质量在280~330 g,实验动物由宁夏医科大学实验动物中心提供[SCXK(宁)2015-0001]。SD 大鼠先经过Morris 水迷宫定位航行实验训练5 d,第6 天筛选出60 s 以内能找到平台的合格SD 大鼠108 只,编号后按随机数字表法,随机分为:DEACMP 组,给予CO 纯品气体腹腔注射[2];空气组,给予空气腹腔注射;空白组,不进行任何预处理。每组36 只大鼠。根据造模前后6 个时间筛选点(造模前、造模后第1 天、第7 天、第14 天、第21 天、第28 天),将DEACMP组、空气组、空白组分别分成6 个亚组,每个亚组6 只,造模过程中死亡的大鼠继续训练补充。
CO 纯品气体(99.99%)购自佛山市科的气体化工有限公司;血气分析仪(Cobasb221)购自Roche公司;Morris 水迷宫分析跟踪系统购自成都泰盟公司;石蜡切片机(Leica Rm2235)购自Leica 公司。
DEACMP 组采用改良式腹腔注射CO 法建立DEACMP 大鼠模型[3](首次注射99.99% CO 纯品气体120 mL·kg-1,后连续注射3 次,每次按照首次剂量的2/3,间隔4 h)。DEACMP 组遵循先造模后抽血的原则,与空气组、空白组从首次造模后2 h 开始检测动脉血碳氧血红蛋白(HbCO)浓度,然后在造模后4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h 检测。每组随机抽取6 只,取股动脉抽血,进行血气分析测HbCO 的浓度。
将大鼠头面向池壁依次从四个象限放入池中,每次航行总时间为60 s,记录大鼠上平台时间,此时间为潜伏期,把大鼠四个象限逃避潜伏期的平均值记为平均逃避潜伏期。在5 d 训练后,若大鼠在60 s 内未找到平台,剔除,随机补充大鼠训练,选出合格大鼠108 只,随机分为DEACMP组、空气组、空白组,每组36 只,根据造模前后检测时间每组又分为造模前、造模后第1 天、第7天、第14 天、第21 天和第28 天共6 个亚组,分别记录各组大鼠的潜伏期,若在60 s 内未找到平台则记录其潜伏期记为60 s。
根据造模前、造模后第1 天、第7 天、第14天、第21 天和第28 天不同时间点完成Morris 水迷宫定位航行实验后,每组6 只大鼠经10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后仰卧位固定于操作台上,先以0.9%生理盐水(约200 mL)灌注,待右心耳流出清亮液体并且肝脏变为黄白色后用4%多聚甲醛(约150 mL/只)灌注,直至大鼠四肢及尾巴苍白僵硬,断头取脑,制备石蜡切片HE 染色,通过HE 染色观察DEACMP 的神经元的变性坏死[4]情况,在40 倍镜下观察,细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染成红色,将被苏木素蓝色深染、变形的细胞核计为“阳性细胞”。采用Image Pro Plus 图像处理软件,对海马CA3 区阳性细胞计数。
应用SPSS 21.0 软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较用SNK-q检验,DEACMP 组的平均潜伏期与阳性细胞计数的相关性分析采用Pearson 相关分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。
大鼠每次中毒数分钟后出现口唇、鼻黏膜、耳朵和四肢末端皮肤呈现樱桃红色改变,持续约2~3 h。部分大鼠在每次中毒后1 h 出现呼吸急促,全是皮毛耸立,行动迟缓,步态不稳,四肢软瘫,小便失禁,持续约1~2 h。少部分大鼠中毒后1 h 出现全身痉挛强直性抽搐、昏迷、呼吸心跳骤停。
DEACMP 组的HbCO 浓度在2 h、4 h、8 h、12 h、16 h时维持在50%以上,20 h、24 h 逐渐下降,各时点HbCO 浓度均高于空白组、空气组(P均<0.05),空白组和空气组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。
DEACMP 组的平均潜伏期与空白组、空气组比较,在造模前、造模后第1 天、第7 天差异均无统计学意义(P均>0.05),而在第14 天、第21 天、第28 天均长于空白组、空气组(P均<0.05)。空白组和空气组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。
表1 DEACMP 大鼠造模后不同时间动脉血HbCO 浓度(±s,%)
表1 DEACMP 大鼠造模后不同时间动脉血HbCO 浓度(±s,%)
与空白组比较*P<0.05;与空气组比较#P<0.05
组别 n 2 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h空白组 6 1.62±0.10 1.46±0.49 1.46±0.36 1.58±0.13 1.57±0.05 1.66±0.09 1.65±0.07空气组 6 1.57±0.32 1.58±0.41 1.52±0.24 1.76±0.18 1.76±0.18 1.57±0.39 1.52±0.27 DEACMP 组 6 70.43±3.63*# 66.80±1.69*# 65.28±2.70*# 65.35±3.24*# 56.35±1.69*# 6.85±0.94*# 2.70±0.61*#F 值 1426.93 5240.96 2182.42 1542.27 4127.38 104.47 11.21 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
表2 DEACMP 大鼠造模前后不同时间点平均潜伏期(±s,s)
表2 DEACMP 大鼠造模前后不同时间点平均潜伏期(±s,s)
与空白组比较*P<0.05;与空气组比较#P<0.05;
组别 n 造模前 第1 天 第7 天 第14 天 第21 天 第28 天空白组 6 20.59±2.56 20.38±2.73 20.45±3.85 18.90±1.96 16.28±2.02 14.02±3.49空气组 6 20.32±1.69 19.41±2.32 21.46±6.01 19.80±1.31 17.37±1.36 14.79±3.53 DEACMP 组 6 19.88±2.41 19.34±1.31 21.45±4.58 33.68±6.78*# 25.23±4.00*# 24.68±11.46*#F 值 0.15 0.42 0.08 24.00 19.53 4.08 P 值 0.86 0.66 0.92 <0.001 <0.001 0.04
造模后第14 天、第21 天、第28 天,HE 染色结果可见DEACMP 组海马CA3 区细胞排列紊乱,细胞的完整结构消失,胞核出现固缩变形、溶解、碎裂,取而代之是被苏木精蓝色深染、变形的阳性细胞。DEACMP 组的阳性细胞计数与空白组、空气组比较,在造模前、造模后第1 天、第7天差异均无统计学意义(P均>0.05),而在造模后第14 天、第21 天、第28 天均多于空白组、空气组(P均<0.05),空白组和空气组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3、图2。
表3 DEACMP 大鼠造模前后不同时间点海马CA3 区阳性细胞计数(±s,个)
表3 DEACMP 大鼠造模前后不同时间点海马CA3 区阳性细胞计数(±s,个)
与空白组比较*P<0.05;与空气组比较#P<0.05;
组别 n 造模前 第1 天 第7 天 第14 天 第21 天 第28 天空白组 6 25.57±2.98 25.36±1.77 25.82±1.53 26.64±1.41 26.91±1.76 27.07±1.44空气组 6 26.27±2.55 26.91±1.86 25.82±1.49 27.33±1.14 25.60±2.83 26.78±1.32 DEACMP 组 6 26.82±2.25 26.22±1.45 25.82±2.46 83.41±14.20*# 70.25±16.50*# 63.88±7.48*#F 值 0.35 1.25 0.88 92.13 40.61 137.17 P 值 0.71 0.31 0.44 <0.001 <0.001 <0.001
对DEACMP 组染毒前后不同时间点的平均潜伏期与阳性细胞计数呈正相关关系(r=0.915,
P<0.001)。
目前制备DEACMP 模型的常用方法有腹腔注射法和吸入法两种方法,虽然有大量研究在比较两种造模方式优缺点[5],但是DEACMP 造模的成功率不高[6],怎么能筛选出可靠的DEACMP 模型是实验中常见的问题,目前关于此方面的研究少,Morris 水迷宫是评价空间学习和记忆功能的常规工具[7],并被广泛用于评估啮齿动物的空间学习和记忆[8]。本实验通过定位航行实验来探讨CO 中毒后对大鼠的神经系统的影响。
Morris 水迷宫检验常用方法是干预后先进行5 d 水迷宫训练,第6 天测试[9],收集平均潜伏期、穿越平台次数等经典指标分析。李勇军等[3]用改良式腹腔注射CO 法建立DEACMP 大鼠模型,选取造模后3 周的这一个时间点,进行Morris 的训练测试。对于迟发性脑病单独取某个时间段行水迷宫实验,只能评价这一时间段CO 中毒后是否发生DEACMP,不能反应中毒后28 d 内DEACMP 发生情况。本实验在中毒后28 d 内,Morris 水迷宫实验筛选模型是可以连续动态测定实验指标,同时可以预判DEACMP 易出现的时间段,为探讨其治疗时机和疗程提供一定的依据。但是Morris 水迷宫定位航行实验属于检测认知功能的行为学方法,初步筛选的模型存在假阳性和假阴性的可能,所以需要在形态学基础上进一步验证模型[10]。DEACMP 的脑损伤广泛,典型表现是在大脑白质的广泛脱髓鞘改变[11],而在基底节区、海马区锥体细胞及小脑神经元出现变性坏死等是最常见的病理改变[12]。海马是参与空间学习和记忆的主要解剖结构[13-14]。Wagatsuma 等[15]研究显示海马CA3 区在海马中形成持久性记忆至关重要。De Bruyckere 等[16]研究表明海马苔藓纤维突触将齿状颗粒细胞连接到CA3 区神经元,并且对于空间记忆形成和巩固是重要的。所以统计海马CA3 区神经元变性坏死的计数,可进一步验证模型。Lin 等[17]和Tabrizian 等[18]用Morris 水迷宫测试海马在空间学习和记忆方面的作用。观察海马区神经元的变性坏死可以直接反应急性CO 中毒后的脑损伤情况,我们采用HE 染色,观察干预后不同时间点大鼠海马区的神经元变性坏死,来证明CO 中毒对大鼠脑神经的损伤。
本实验从采用腹腔注射染毒,按照刘勇林等[19]研究,使HbCO 浓度大于50%,持续16 h 以上,从而达到中-重度CO 中毒的标准,提高造模的成功率。本实验观察从造模后第14 天开始,DEACMP 组的平均潜伏期、阳性细胞数与空白组、空气组对比升高,说明从急性CO 中毒后第14天开始,大鼠空间学习和记忆开始出现有损伤表现,海马CA3 区神经元开始出现变性坏死,提示大鼠急性CO 中毒后14 天可能为DEACMP 的好发时间段,与张晓莉等[2]在急性DEACMP 大鼠模型的建立及其表型评价中的结论基本相符,为探讨DEACMP 发病机制及治疗时机提供依据。Tabrizian 等[20]和彭璇等[21]通过Morris 水迷宫实验能检测海马在空间记忆获取的行为能力。对DEACMP 组的平均潜伏期与阳性细胞计数进行直线相关分析显示,平均潜伏期和阳性细胞数之间存在正相关,提示在急性CO 中毒后观察的28 d 内,Morris 水迷宫的定位航行实验是一种检测DEACMP 大鼠认知功能的可靠方法。Morris 水迷宫实验包括定位航行和空间探索两部分,单用定位航行实验可以简化实验步骤,同时又可以准确反应DEACMP大鼠认知功能的改变。
在本实验过程中Morris 水迷宫结果也受到多方面的影响,要注意Morris 水迷宫的操作规范[22],才能保证实验结果的真实可靠,总结本实验操作过程中的注意事项及解决方法:(1)泳池内水温,温度计测量泳池内的水温保证在(20±1)℃[23]。(2)每次训练测试前,通过视频软件固定平台的坐标位置,保证平台的位置固定,实验开始时视频监控下平台位置不能显现,避免影响老鼠的空间记忆,干扰实验结果。
综上所述,本研究表明在造模前后不同时间段,Morris 水迷宫的定位航行试验是一种简易的检测DEACMP 大鼠认知功能的可靠方法;通过筛选DEACMP 大鼠模型,发现在染毒后7~14 d开始有行为学和病理学改变,尤其以急性CO 中毒后第14 天最明显,可能是DEACMP 的颅脑损伤最严重的时间段,具体机制需要进一步研究。筛选出成功的DEACMP 模型是探讨其发病机制及治疗方法的基础,后续将进一步采用多种行为学检测方法和大脑白质的广泛脱髓鞘等指标来检测大鼠脑神经的损伤程度。