人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定

杜阳阳，张 放，苗智颖，赵 红，马 迪，王 静，李淑英，郑春阳，李劲涛

宫颈癌发病率在世界范围内居女性恶性肿瘤的第二位，是危及全球妇女健康的严重疾病，据国际癌症中心(IARC)估计，全球每年宫颈癌新发病例数约52.8万，死亡人数约26.6万[1]。研究证明，人乳头状瘤病毒 (human papillomavirus，HPV) 中13种高危型长期反复感染是宫颈癌发生的必要条件[2-4]；有研究表明HPV 58型在我国感染率较高[5-6]。尽管Gardasil 9 (HPV9价疫苗)已经在世界范围内上市，该疫苗可预防9型HPV所致某些疾病(包括HPV型16，18，31，33，45，52和58型所致宫颈癌、外阴癌、阴道癌和肛门癌，以及HPV 6或11型所致尖锐湿疣)[7-8]，然而这种疫苗只适用于没有感染过HPV的人群，对于已经感染上述相应型别HPV而导致的病变患者没有作用，因此，研制HPV58型治疗性疫苗是非常必要的。依据上述事实和原理，本项研究以HPV58突变型E6E7(Mutant type E6E7，mE6E7)融合基因为靶点，用HPV58野生型E6E7(Wild type E6E7，wE6E7)融合基因片段作对照，利用对人无致病性的巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102 Towne bacterial artificial chromosome，SW102-T-BAC)为载体，构建携带HPV58 mE6E7及wE6E7融合基因的重组巨细胞病毒，探讨HPV58mE6E7的转化活性，为HPV58型治疗性疫苗研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 GalK质粒(pGalK), 对人无致病性的巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102 Towne bacterial artificial chromosome，SW102-T-BAC)包含巨细胞病毒的全基因组，并带有氯霉素抗性基因，为美国罗格斯大学，新泽西医学院朱桦教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1HPV58 E6和E7野生型与突变型融合基因片段的合成 HPV E6和E7基因特有的Cys-x-x-Cys基序具有锌指结构与抑癌基因p53，Rb结合并降解抑癌基因。为消除E6，E7基因可能的恶性转化活性，将锌指结构进行突变[9-10]，构建E6E7突变型融合基因。根据GenBank提供的基因编码区序列， 对野生型基因序列加以改造，同时将E7与E6之间的终止子进行改造，使其形成连续编码序列，而形成融合基因(具体改造方法见图1)，这样mE6E7融合基因保证了读码框的正确性，既可消除E6与E7的转化活性又能保留其抗原性。委托北京赛思莱博科技有限公司合成突变型E6E7(mE6E7)与野生型E6E7(wE6E7)融合基因。

1.2.2带有T-ORF75左/右同源臂GalK、HPV58 wE6E7与mE6E7融合基因引物的设计及片段扩增

1)依据GenBank提供的Towne株(FJ616285.1)基因序列，分别设计其开放读码框ORF75(Towne-ORF75左/右同源臂GalK，HPV58 E6E7融合基因引物(见表1)。委托北京赛思莱博科技有限公司引物合成。2)用所设计引物，以质粒GalK、HPV58 wE6E7及mE6E7融合基因片段为模板，分别扩增GalK片断、野生型及突变型融合基因wE6E7与mE6E7片段，反应体系 (100 μL)：PCR mix包括Buffer、dNTP Mixture及Taq DNA polymerase，primers 10 μmol/L (表1 GalK Primers及HPV58 E6E7 Primers)， 和 200 ng GalK质粒DNA。 PCR反应循环：95 ℃/15 min； 31个循环95 ℃/30 s；55 ℃/30 s；72 ℃/1.5 min； 延伸72 ℃/10 min，4 ℃储存。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并切胶纯化回收。

表1 本项实验中所需引物名称、序列及大小
Tab.1 the name, sequence and size of the primers required in this experiment

引物名称序列产物大小/bpGalk Primers GalK ForwardcaaccaccacctggatcacgccgctgaacccagcggcgcggccgcgctatgCCTGTTGAC-AATTAATCATCGGCA GalK Reversegctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccg-TCAGCACT-GTCCTGCTCCTT1 400HPV58E6E7 Primers HPV58E6E7 Forwardcaaccaccacctggatcacgccgctgaac-ccagcggcgcggccgcgctatgATGTTCCAGGACGCAGAGGAG HPV58E6E7 Reversegctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccg TCCTTGCTG-TGCACA GCTAG861Galk Check Primers Check Forwardgcgacttttgtaacccgtag Check Reversegcagtaggtgaaacgctttg1 550HPV58E6E7 check Primers Check Forwardgcgacttttgtaacccgtag Check Reversegcagtaggtgaaacgctttg1 012

1.2.3将已纯化的Galk片段插入Towne开放读码框75(T-ORF75) 将上述纯化的GalK片段电转到SW102-T-BAC感受态细胞，然后用1 mL LB培养液，于32 ℃振摇1 h后，离心，再用1×M9液洗涤沉淀物2次，将洗涤后的菌均匀涂布于M63配制的含有Galk的培养基[7]，在32 ℃培养3 d后长出细菌克隆；挑选3个克隆，提取质粒DNA，PCR检测GalK(表1 GalK Check Primers)。检测正确克隆质粒命名为SW102-T-ORF75-GalK-BAC。并制备其电转感受态细胞，负80 ℃储存备用。

1.2.4HPV58E6E7融合基因代替GalK基因 取约800 ng已纯化的T-ORF75左/右同源臂HPV58 wE6E7与mE6E7融合基因片段，分别电转化到SW102-T-ORF75-GalK-BAC感受态细胞，用1 mL LB培养液，于32 ℃振摇4 h 30 min，离心，再用1×M9液洗涤细菌沉淀物2次，将细菌沉淀物混悬于1 mL M9洗涤液后，分别在进行10倍及100倍稀释后，用不同浓度的稀释菌液涂布于脱GalK培养基[11]，32 ℃培养3 d，有克隆形成；分别选2个克隆，提取质粒DNA，PCR检测(表1 HPV58E6E7 Check Primers)，正确克隆命名为SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC，SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC。

1.2.5转染 ARPE-19细胞接种于12孔细胞培养板，常规培养，待ARPE-19细胞生长到汇合度为60%时，用脂质体介导分别将SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC与SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC质粒转染ARPE-19细胞，每种质粒转染3个复孔，剩余培养板中的3个孔细胞作为对照。24 h后将细胞培养液更换；并且每天观察细胞生长状况。待细胞长满各孔后，转移到培养皿(直径为10 cm)继续培养。

1.2.6转染细胞中HPV58 mE6E7与wE6E7表达状况 待10 cm培养皿中细胞完全汇合后，收集各组细胞，分别提取各组细胞RNA，逆转录PCR扩增检测所收集细胞中HPV58 mE6E7与wE6E7的表达，并将PCR产物测序分析。

1.2.7软琼脂克隆实验 底层软琼脂制备：配制1.5%琼脂10 mL高压灭菌，待其冷却至大约50 ℃，加入2XDMEM 10 mL，混均，于24孔板的每个孔中加入0.8 mL，于室温使其凝固。

上层琼脂制备：将10 mL已灭菌含0.7%琼脂冷却至大约50 ℃，迅速加入10 mL含20%血清的2XDMEM培养液和稳定表达SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC与SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC及未转染的ARPE-19对数生长期细胞(浓度为3×103个/mL)，混匀，浇入底层铺有软琼脂的24孔培养板中，每组细胞接种6个复孔，琼脂凝固后将培养板放置在5% CO2、温度为37 ℃及饱和湿度环境下培养12 d。每天在倒置显微镜下观察软琼脂中细胞克隆形成情况，并记录克隆形成数量，以分裂3次增殖8个细胞作为1个克隆，计算克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。

2 结 果

2.1HPV58 E6和E7野生型与突变型融合基因片段的合成 将HPV58 E6蛋白降解P53的活性部位、E7蛋白与pRB结合位点关键氨基酸改造后，所得片段基因序列如图1。

图1 HPV58 E6E7野生型与突变型融合基因突变位点序列Fig.1 HPV58 E6E7 fusion gene sequence of Wild-type and Mutant type

2.2GalK插入SW102-T-ORF75-BAC GalK培养基中培养3 d后，选取其中3个菌落，提取质粒DNA，以3个菌落质粒DNA为模板PCR扩增，检测到大小为 1 550 bp的PCR产物(图2)，所得产物大小与预期结果相一致，表明GalK已克隆至Towne细菌人工染色体的开放读码框75，将正确克隆命名为SW102-T-ORF75-GalK-BAC。

M为1kb plus DNA ladder，1为阴性对照，2-4为GalK插入SW102-T-ORF75-BAC后，所选取的GalK培养基中生长的3个克隆，以所选的3个克隆质粒DNA为模板，PCR产物电泳的结果。图2 GalK克隆到SW102-T-ORF75-BAC后PCR扩增检测结果Fig.2 Results of PCR amplification for detection GalK cloned to SW102-T-ORF75-BAC

2.3HPV58E6E7融合基因代替galK基因 经过脱GalK培养基培养后，分别选取2个菌落，检测到大小为1 012 bp的PCR扩增产物(图3)，所检测到的片段与预期结果一致，证实HPV58 wE6E7与mE6E7分别克隆至SW102-T-ORF75-GalK-BAC。正确克隆命名为SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC，SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC。

M为1kb plus DNA ladder，1是阴性对照，2-3 ：HPV58-mE6E7替代GalK所选2个克隆PCR扩增后电泳结果，4-5：HPV58 wE6E7替代GalK所选2个克隆PCR扩增后电泳结果。图3 HPV58 mE6E7与wE6E7插入SW102-T-ORF75-GalK-BAC替代GalK所选克隆PCR扩增后电泳结果Fig.3 Results of PCR amplification for verification galk replaced by HPV58-mE6E7与wE6E7 in SW102-T-ORF75-GalK-BAC

2.4转染与未转染细胞生长状况 分别将 SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC与SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC质粒转染ARPE-19细胞，培养10 d 后，在倒置显微镜下观察，转染SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制，出现重叠生长现象，其形态由原来长梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多(图4)。

A为未转染细胞; B为转染SW102-T-BAC至ARPE-19的细胞; C为转染SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC至ARPE-19的细胞;D为转染SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC至ARPE-19的细胞。图4 转染ARPE-19细胞生长状况(倒置显微镜下观察结果 ×200)Fig.4 Growth of ARPE-19 cells were transfected (The results were observed under an inverted microscope ×200)

2.5转染与未转染细胞中T-ORF75-HPV58-mE6E7与T-ORF75-HPV58-wE6E7表达状况 第20 d 收集转染后细胞，分别提取各组细胞RNA，逆转录PCR检测T-ORF75-HPV58-mE6E7与T-ORF75-HPV58-wE6E7 表达状况，逆转录PCR检测到转约250 bp、1 012 bp及1 012 bp PCR产物，分别为转染SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC的结果(图 5)。 测序分析表明HPV58-mE6E7与HPV58-wE6E7稳定表达于转染的细胞中。

M为1kb plus DNA ladder，1：将SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC转染 ARPE-19细胞，培养后提取细胞RNA，逆转录PCR扩增产物电泳的结果；2：将SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC 转染 ARPE-19细胞，培养后提取细胞RNA，逆转录PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果；3：用SW102-T-BAC转染细胞ARPE-19，将转染的细胞培养后提取RNA，然后逆转录PCR扩增产物电泳的结果，4：将未转染细胞提取的RNA，进行逆转录PCR扩增，其产物电泳的结果；5：是阴性对照。图5 细胞中T-ORF75-HPV58-mE6E7与T-ORF75-HPV58-wE6E7逆转录PCR检测结果Fig.5 Results of reverse transcription PCR of T-ORF75-HPV58-mE6E7 and T-ORF75-HPV58-wE6E7 in transfected cells

2.6软琼脂克隆实验 以分裂3次增殖8个细胞作为一个克隆，培养至第6 d，在倒置显微镜下可观察到稳定表达T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC的细胞组有克隆形成，而稳定表达T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC、T-BAC及未转染的ARPE-19细胞未见克隆形成；培养至12 d，克隆明显增多增大，细胞呈堆积生长(图6)，克隆形成率为23.5%(47/200)。稳定表达T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC、 T-BAC、及未转染的ARPE-19细胞组未见有克隆形成。

图6 转染SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7的ARPE-19细胞在软琼脂中形成的典型克隆(×200)Fig.6 Clone of ARPE-19 cells were transfected with SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7 in soft AGAR(×200)

3 讨 论

虽然世界范围内已有HPV预防性疫苗上市[8,12]，预防HPV疫苗可保护健康人群免患相应型别HPV感染所导致的疾病，但对已感染相应HPV型别患病的人群没有治疗的效果，对已感染各型别HPV导致的各类疾病，还需相应的治疗性疫苗。目前治疗性HPV疫苗还处于研发阶段，理想治疗性HPV疫苗既要在患者体内产生强的细胞免疫，又要清除患者体内已感染的HPV，同时还要在患者体内产生中和抗体，中和患者体内病毒，而抑制病毒的传播。

高危型HPV感染的恶性肿瘤中，E7与E6蛋白是形成HPV相关恶性肿瘤及维持其恶性表型所必需的蛋白；E6通过降解P53，降低细胞对DNA合成修复能力，容易出现错误的基因结构；E7与pRb基因结合，诱导中心体合成异常增多，使得有丝分裂异常紊乱，非整倍体细胞出现，从而导致细胞的恶性转化[13-14]。E6和E7两个癌基因在HPV阳性恶性肿瘤细胞中持续表达，而在正常细胞中不表达，因此，E6和E7蛋白属于肿瘤细胞中特异性的病毒抗原，是HPV阳性肿瘤免疫治疗的理想靶抗原，可将HPV E6和E7基因加以改造研制成治疗性疫苗；但如果用野生型E7与E6基因直接作抗原，构建E6E7融合基因，有潜在致癌性；因此，需将野生型E7基因与pRB基因结合位点加以改造，E6降解P53基因位点加以改造，使其发生突变，敲除E7与E6基因的转化活性，并将E7与E6各自的终止密码子加以改造，这样所构建的突变型融合基因，既保留了其抗原性，又去除了其致癌性，同时，也保证了融合基因读码框的正确性。因此，本项研究将E6基因结合p53、E7结合Rb活性部位锌指结构域内一些氨基酸序列加以改变，消除E6结合p53、E7结合Rb基因的降解活性，即E6第50位的亮氨酸在高危HPV中高度保守，可能在E6转化过程中起重要作用；第63位和第106位的半胱氨酸位于E6的一对锌指结构的两侧，在对p53的结合中起重要作用。E7中第24位半胱氨酸和第26位谷氨酸位于一对锌指结构的两侧，第92位半胱氨酸位于一个独立的锌指结构中[10]，因此，我们将这些部位碱基序列加以改变，消除E6终止密码子，并保证E6与E7读码框的正确性，使其形成融合基因，分别构建了HPV58mE6E7和HPV58wE6E7融合基因的重组病毒。通过转染细胞形态学观察及软琼脂克隆实验证实所构建的重组病毒T-ORF75-HPV58-mE6E7已消除致癌活性。

利用Towne细菌人工染色体为载体，通过同源重组，已成功将HPV58E6E7融合基因连接到Towne的ORF75；Towne的ORF75编码包膜糖蛋白gH，具有免疫原性，在诱导宿主免疫反应方面发挥着重要作用。今后将进一步探讨重组病毒T-ORF75-HPV58-mE6E7的免疫原性、免疫反应性及其作为治疗性疫苗的免疫效果。

本项研究采用巨细胞病毒减毒活疫苗Towne株[15-16]细菌人工人色体为载体，构建表达HPV58E6E7去除其转化活性融合蛋白的重组巨细胞病毒，并转染ARPE-19细胞，结果显示已成功构建了携带Towne-ORF75-HPV58 mE6E7与wE6E7基因的重组病毒，为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。

利益冲突：无