广州市香港海鸥型菌红霉素耐药性与基因分析

张铮峰，张冰纯，王盼盼，陈定强，赵路宁，余 琳

香港海鸥型菌属原核细菌(Proteobacteria)I3亚纲，奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)，学名为香港海鸥型菌(Laribacterhongkongensis，LH)。它是新发现的被证实与社区性胃肠炎和旅行者腹泻有关的细菌[1]。它和产酸克雷伯菌 (Klebsiellaoxytoca)、产肠毒素脆弱拟杆菌 (EnterotoxigenicBacteroidesfragilis,ETBF) 被美国学者确认为21世纪来新发现的3种可以引起人急性腹泻的病原菌[2]。淡水鱼和蛙类是该菌的主要宿主[3]。在2012年，我们课题组在广州医科大学附属第一医院的门诊腹泻病人粪便标本中首次发现多重耐药的香港海鸥型菌[4]，命名为HLGZ1，此菌对革兰氏阴性杆菌的临床常用抗生素均耐药，因此我们开始观察其他类抗生素(如红霉素等)的耐药情况，以及红霉素耐药相关基因ereA、ereB、ermA、ermB、ernC、MefA/E、mphA、SAT4、MsrA的携带情况，分析该菌对红霉素耐药的基因状态，以便进一步为临床正确用药提供指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1菌株来源 2016年1-9月期间，从广州8个不同的零售市场采集草鱼和青蛙肠道标本，通过分离培养，生化鉴定和香港海鸥型菌16S rRNA基因特异性序列测序，最终确定122株为香港海鸥型菌株，由广州医科大学附属第一医院检验科保存。其中鱼源株85株，蛙源株37株。

1.1.2主要试剂 血琼脂平板、红霉素药敏纸片(环凯公司)，MH平板、营养肉汤(生物梅里埃公司)，DNA提取试剂盒、200 bp Maker Ⅲ(天根有限公司)。引物合成自生工生物工程(上海)股份有限公司，PremixTaqDNA 聚合酶为TaKaRa 公司产品。

1.1.3标准菌株 大肠埃希氏菌ATCC25922 和金黄色葡萄球菌ATCC25923由广州医科大学附属第一医院检验科保存，并作为药敏试验的质控菌株。

1.1.4主要仪器 PCR扩增仪(伯乐公司)、电泳仪(北京六一仪器厂)、凝胶成像分析系统(英国Syngene 公司)、生物安全柜(Thermo公司产品)、生物培养箱LRH-250A(广州医疗器械厂)、低温超速离心机(Eppendorf公司)、电子分析天平(上海民桥精密科学仪器厂)和0.5麦氏比浊仪(梅里埃公司)。

1.2 方 法

1.2.1红霉素的耐药性测定 按照CLSI的纸片扩散法(K-B法)测定122株香港海鸥型菌对红霉素的敏感性。使用游标卡尺测量抑菌圈并记录，结果判读根据CLSI标准进行。

1.2.2DNA模板的制备 采用天根柱式DNA提取试剂盒，按照说明书提取菌体DNA。将提取的模板DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3红霉素耐药基因检测

1.2.3.1引物 参照文献[5-7]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成ereA，ereB，ermA，ermB，ernC，MefA/E,mphA,SAT4红霉素耐药基因的引物。

1.2.3.2PCR反应体系的配置 反应体系共25 μL，其中包括12.5 μL pcr mixTaqDNA聚合酶、10.5 μL双蒸水、上下游引物各0.5 μL和1 μL DNA模板。PCR 反 应 条 件 为：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性 30 s， 50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，34 个循环；最后 72 ℃延伸 3 min。

1.2.3.3PCR产物分析 取0.6 μL扩增产物加样于1.5%琼脂糖凝胶中(使用DD染料配制)，在130 V电压下电泳15 min，用凝胶成像系统观察并保存图片。

2 结 果

2.1药敏结果 122株香港海鸥型菌对红霉素耐药率为29.5%(见表1)。

表1 122株香港海鸥型菌的耐药性
Tab.1 Drug resistance of LH(122)

抗生素名称鱼源株(n=85)蛙源株(n=37)合计(n=122)耐药株耐药率%耐药株耐药率%耐药株耐药率%红霉素2225.91335.13528.7

2.2耐药基因分布 只在蛙源耐药株中检出红霉素抗性基因ereA，检出率为30.8%，提示海鸥菌蛙源株对红霉素产生的耐药性与ereA基因相关(见表2)。

2.3耐药基因检测结果 420 bp处出现ereA目标条带(见图1)。

注：M为Marker；1为ereA(420 bp)；3为ereA(420 bp)；4为ereA(420 bp)图1 耐药基因(ereA)PCR电泳结果Fig.1 PCR result of resistance gene(ereA)

表2 耐药基因携带情况
Tab.2 Carriage of durg-resistance genes

抗生素基因鱼源株(n=22)蛙源株(n=13)合计(n=35)检出株检出率(%)检出株检出率(%)检出株检出率(%)ereA00430.8411.4ereB000000ermA000000ermB000000红霉素ermC000000MefA/E000000msrA000000mphA000000Sat4000000

2.4部分基因测序结果 通过与GenBank上的ereA基因(编号AF466410.1)比对，同源性达99%(图2)。

图2 测序结果Fig．2 Sequencing result

3 讨 论

由于广东省地处珠江三角洲地区, 毗邻香港，属亚热带气候,温热多雨, 居民素喜食鱼、虾、蟹等淡水产品, 因此，存在引发人群食源性疾病的潜在危险。目前国内和国外均有香港海鸥型菌所致人胃肠炎的临床病例报道,香港地区为首次报道从社区胃肠炎患者粪便中培养出香港海鸥型菌[1]；我国内地浙江省杭州市及广东省江门市均发现腹泻患者大便标本中存在该菌，并确定该菌是患者腹泻的病原菌[8-9]，香港海鸥型菌在世界各国如丹麦、美国、韩国等地均有人体感染致腹泻或胃肠炎的报道[10-12]，说明香港海鸥型菌是导致人类腹泻病原菌之一，而且作为一种新发现的病原菌，在世界范围内广泛存在，但其致病机制与耐药机制尚不明确。在2012年，我们团队在腹泻病人粪便发现泛耐药HLGZ1中存在很多耐药基因，插入序列和I类整合子等元件，表明耐药基因在香港海鸥型菌中存在水平传播的现象[4]。

目前，我国滥用抗生素的情况依然十分严重，多重耐药甚至泛耐药细菌的出现应当起人们的警惕。故本课题组开展香港海鸥型菌红霉素耐药性研究对于预防和治疗其引起的感染具有重要意义。本研究122株香港海鸥型菌中对红霉素耐药株有35株，耐药率达28.7%，表明香港海鸥型菌对红霉素耐药较为严重。这与以往广州地区研究结果相吻合，如王祉蕴等[13]分离的54株LH中有15株对红霉素耐药，耐药率为27.78%；王丽等[14]分离的122株海鸥菌有23株对红霉素耐药，耐药率为18.9%。但不同地区间有差异，冯梅等[15]在深圳地区分离的108株LH中有6株对红霉素耐药，耐药率为5.56%。

本研究同时发现蛙源株对红霉素的耐药率比鱼源株要高；同时检测常见导致细菌红霉素耐药的基因：ereA和ereB(通过表达红霉素酯酶使红霉素酯解失活引起细菌耐药)、ermA、ermB和ermC(通过表达红霉素甲基化酶，导致细菌核糖体23sRNA基因甲基化，红霉素对其作用失效而耐药)、MeFA/E(编码转运蛋白将红霉素类药物泵出细菌细胞外而导致耐药)和mphA(其表达产物可以使红霉素脱氧二甲胺己糖C-2位置发生磷酸化或糖基化而失去活性)。结果只在蛙源耐红霉素株中检出其相关抗性基因ereA，检出率为30.8%，提示海鸥菌蛙源株对红霉素产生的耐药性与ereA基因相关，可能通过ereA基因表达红霉素酯酶使红霉素酯解失活，引起对红霉素耐药；而红霉素耐药的鱼源株耐药性与ereA无关。

香港海鸥型菌自发现至今已有18年，大部分的文献报道均针对该菌的分离情况和表型进行研究。近年来开始对该菌的致病机制和耐药机制进行深入研究。而该菌对红霉素耐药及传播机制仍不明确，国内外均无相关文献报道。故本研究通过对香港海鸥型菌红霉素耐药株的相关耐药基因ereA，ereB，ermA，ermB，ernC，MefA/E，mphA，SAT4进行分析，为进一步探究香港海鸥型菌对红霉素的耐药机制和临床防治耐药株提供实验室数据。

香港海鸥型菌的主要宿主是水产品(淡水鱼和蛙)，多种抗生素耐药菌的出现应引起养殖业对滥用抗生素的警惕，建议对抗生素市场进行更严格的监管。

利益冲突：无