山东济宁骚扰库蚊对常用杀虫剂的抗性研究

王 洋，杨琳琳，杨秋兰，刘宏美，宋 晓，程 鹏，王海防，王海洋，王怀位，刘丽娟，郭秀霞，张崇星，赵玉强，公茂庆

骚扰库蚊(Culexpipiensmolestus)属于库蚊属(GenusCulex)、库蚊亚属(SubgenusCulex)、尖音库蚊复合组(Cx.pipiensComplex)，在我国此复合组还包括尖音库蚊指名亚种(Cx.pipienspipiensLinnaeus，1758)、致倦库蚊(Cx.pipiensquinquefasciatusSay，1823)、淡色库蚊(Cx.pipienspallensCoquillett，1898)。骚扰库蚊属于自育性蚊虫，即雌蚊在不吸血的情况下也能进行卵黄生成的过程，并可成功产卵。蚊虫的自育现象首先在尖音库蚊[1](Cx.pipiens)中被发现，此后相继证明骚扰库蚊[2]、白纹伊蚊[3](Aedes.albopictus)、三带喙库蚊[4](Cx.tritaeniorhynchus)等也存在自育现象。骚扰库蚊主要分布于西欧、中欧、北非、苏丹、澳大利亚及北美等地[5]。在我国，北京、辽宁、内蒙古、上海、湖北[6-7]等地均有记录。本文在进行济宁地区淡色库蚊抗药性调查时，将采集的幼虫带回实验室培育，发现蚊虫具有自育性，经初步形态学鉴定确定为骚扰库蚊。因此，我们进行了分子生物学鉴定确定济宁地区首次发现骚扰库蚊，并对其进行多种杀虫剂抗性水平的研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1野外种群 2018年6月从济宁市某小区半地下车库积水中采集库蚊幼虫，带回实验室饲养至羽化，成蚊仅给予5%糖水喂食，不喂食血液而自育性产卵传代饲养。敏感品系：骚扰库蚊研究较少，无敏感品系存在，因此，我们选用山东省寄生虫病防治研究所常规饲养的淡色库蚊敏感品系作为参考。饲养条件：温度(25±1)℃、光周期：14 L∶10 D、相对湿度(70±10)%。

1.1.2主要仪器与试剂 仪器：SpectraMaxQuickDropTM超微量分光光度计(美国Molecular Devices)；DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂)；Bio-Rad ChemiDoc XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad)。试剂：DNeasyBlood & Tissue Kit(德国Qiagen)；PrimeSTARHS DNA Polymerase(大连TaKaRa)；E.Z.N.A.MicroElute Gel Extraction Kit(美国Omega Bio-tek)。杀虫剂：DDVP(93%，油剂)、残杀威(96%，粉剂)、氯氰菊酯(95%，油剂)、溴氰菊酯(98%，粉剂)为上海保康化工有限公司生产；苏云金杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensisisraelensis，Bti)(600 IU/mg，颗粒剂)，由山东鲁抗舍里乐药业有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1形态学鉴定 随机挑选一定数量的骚扰库蚊雄蚊尾器制作成标本进行鉴定[6]。将标本置于光学显微镜下观察，根据尾器中阳茎内叶、中叶的相对位置和形态特征进行种类比对和鉴定。

1.2.2PCR实验 采用DNeasyBlood & Tissue Kit进行蚊虫DNA提取，SpectraMaxQuickDropTM超微量分光光度计测量提取样品的DNA浓度。参照文献[8]设计特异性引物F(5′-GATCCTAGCAAGCGAGAAC-3′)和R(5′-CCCTCCAGTAAGGTATCAAC-3′)PCR扩增骚扰库蚊CQ11基因片段，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应体系(50 μL)：5× PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃退火15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，凝胶成像仪读取结果。用DNA凝胶回收试剂盒进行回收与纯化目的基因片段，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果在NCBI网站进行blast比对分析。

1.2.3骚扰库蚊抗性测定 幼虫浸渍法[9]，分别测试骚扰库蚊现场种群以及淡色库蚊敏感品系对DDVP、残杀威、氯氰菊酯、溴氰菊酯、Bti 5种杀虫剂的敏感性。随机选取孵化饲养至III龄末IV龄初的幼虫为测试对象，将待测的5种杀虫剂原液首先配制成母液，通过预实验确定药液的系列浓度范围，进而稀释成5个不同的系列浓度。实验组：将25只幼虫放入盛有100 mL不同系列浓度药液的白瓷碗中，每种药液各浓度重复3次。以丙酮作为对照组，观察并记录现场种群以及敏感品系幼虫接触药液24 h后的死亡数(用玻璃棒轻轻触动幼虫，以之无移动或呈痉挛状态视为死亡)。根据每一浓度对应的蚊虫死亡率，将药液剂量取对数、蚊虫死亡率转换为概率单位进行回归分析，求出半数致死浓度(LC50)值。若对照组死亡率大于20%，则该实验组数据作废。

1.2.4数据处理 测定结果用SPSS19.0软件计算每种药液LC50值、毒力回归方程、95%置信区间(95%CI)及抗性倍数(RR)。

1.2.5结果判定 RR=野外种群LC50/敏感品系LC50，RR≥20，为高度抗性；10≤RR<20，为中度抗性；2≤RR<10，为低度抗性；RR<2，为敏感。

2 结 果

2.1形态鉴别 骚扰库蚊雄蚊尾器阳茎侧板腹内叶外伸部分细短而呈钩状，背中叶末端平齐，而本地区常见的淡色库蚊雄蚊尾器阳茎侧板腹内叶外伸部分宽而呈叶状，背中叶末端平齐或圆钝[10-11](见图1)。

图1 骚扰库蚊与淡色库蚊尾器特征(图片来源文献[11])Fig.1 Morphological character of the genital is between Culex pipiens molestus and Culex. pipiens pallens

2.2扩增产物的鉴定及核苷酸序列分析 经1%的琼脂糖电泳得到约250 bp左右的目的片段，与理论大小相符(图2)。PCR产物测序结果在NCBI网站上进行blast比对，与数据库中骚扰库蚊CQ11基因相似性为96%(图3)。

2.2骚扰库蚊抗性测定 济宁市骚扰库蚊幼虫对5种常用杀虫剂LC50分别为DDVP 11.311 7 mg/L、残杀威5.859 9 mg/L、氯氰菊酯0.022 7 mg/L、溴氰菊酯0.014 0 mg/L、Bti 6.963 8 mg/L，均表现为不同程度的抗药性(表1)。根据抗药性水平判断标准可知，济宁市骚扰库蚊幼虫对其中4种杀虫剂(DDVP、残杀威、氯氰菊酯、溴氰菊酯)达到了高度抗性(抗性倍数分别为117.34、53.47、113.50、140.00)，而对Bti为低度抗性(抗性倍数为2.71)。

M为DNA标志物(DL 2000)；1为骚扰库蚊CQ11基因PCR扩增产物图2 基因片段扩增电泳结果Fig.2 Electrophoresis results of gene fragment amplification

图3 基因片段核苷酸相似性比较Fig.3 Comparison of nucleotide similarity of gene fragments

表1 骚扰库蚊对5种杀虫剂的抗药性状况
Tab.1 Resistance ofCulexpipiensmolestusto five insecticides

杀虫剂试虫来源LC50 (mg/L)回归方程y=(a+bx)95%CI (mg/L)RRDDVP地下车库11.311 7y=3.821 3+1.118 8x2.520 4～50.766 4117.34敏感品系0.096 4y=5.890 5+0.876 4x0.052 9～0.175 71.00残杀威地下车库5.859 9y=4.419 2+0.756 4x0.658 0～52.187 853.47敏感品系0.109 6y=6.248 5+1.300 5x0.072 1～0.166 61.00氯氰菊酯地下车库0.022 7y=6.786 6+1.086 4x0.016 1～0.032 0113.50敏感品系0.000 2y=5.931 5+1.313 1x0.000 1～0.000 21.00溴氰菊酯地下车库0.014 0y=6.506 6+0.812 6x0.008 7～0.022 6140.00敏感品系0.000 1y=5.845 3+0.912 0x0.000 1～0.000 21.00Bti地下车库6.963 8y=4.162 6+0.993 5x3.671 2～13.209 82.71敏感品系2.573 4y=4.311 2+1.678 0x1.983 0～3.339 41.00

3 讨 论

济宁地区生态环境复杂，适宜多种蚊虫孳生。随着济宁城市化水平的明显提高，各种地下基础设施(住宅小区地下室、地下商业街、地下车库、污水管网)建设规模逐渐增大，蚊虫的栖息场所和行为受到了很大的影响。本研究首次在山东济宁地区发现了骚扰库蚊孳生场所，并对骚扰库蚊进行了抗性水平评价。

骚扰库蚊与淡色库蚊形态非常相似但是生物学行为不同，其特点为具有自育性，可在有限的空间内交配，缺乏冬季滞育，喜嗜人血，主要生活在封闭或半封闭的地下环境中[12]。有研究表明，骚扰库蚊在不补血的情况下维持10代后，其产卵率并不会下降，可以持续维持专性自育，而且在同一实验室条件下饲养的不同种群的骚扰库蚊在自育性、繁殖力、生命周期等生活史特征上表现也不同，这些差异可能和骚扰库蚊与同域亚种的基因交换引起的遗传差异有关[11]。本次蚊虫收集地点的孳生水体位于半地下车库，其与车库外部空间无直接接触，整体相对封闭，适宜骚扰库蚊孳生。Gao Q等[13]曾报道过上海地区骚扰库蚊在尖音库蚊复合组的比例，露天地上环境可达到30%，而在地下栖息地(地下车库)的部分地点骚扰库蚊构成比可达到100%[14]。张杰等[15]发现上海市杨浦区的全封闭型小空间地下车库内的蚊虫均为骚扰库蚊，全封闭型大空间地下车库内，骚扰库蚊的比例可达54.09%，而在半封闭型地下车库环境中，骚扰库蚊数量较少。因此，他们认为地下车库内的蚊种与其孳生水体的密闭程度有关，越密闭则骚扰库蚊的比例越高，反之，淡色库蚊和致倦库蚊的比例增高。

研究表明，骚扰库蚊作为西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)的传播媒介，其特殊的生物学行为使其能够在冬季存活下来。WNV通常在鸟类和蚊子间循环传播，人主要通过被蚊虫叮咬而感染。WNV传入北美后的严峻的流行形势，突显了外来的虫媒病毒对本地区潜在的公共卫生威胁，冬季存活下来并且携带病毒的骚扰库蚊可能为春季北美西尼罗热疫情快速蔓延的关键因素[14,16]。中国新疆地区发现尖音库蚊体内有WNV的存在及WNV造成的相关病毒性脑炎的流行[17]，而且我国存在着大量可以携带WNV的蚊类，全球候鸟迁徙的路线有3条经过中国[18]，随着中国与世界其他各国之间人员往来的频繁，WNV在济宁甚至中国北方地区流行的可能性是存在的。在地表水匮乏的旱季，传播媒介78%可能来自地下栖息地[19]，因此，骚扰库蚊是研究WNV等虫媒病毒的良好媒介[20]。

骚扰库蚊对杀虫剂的抗性情况在国内报道很少，姬淑红等[21]研究了上海地区骚扰库蚊对多种杀虫剂的抗性水平，结果显示骚扰库蚊对溴氰菊酯抗性倍数为192.59，与本次测试结果的抗性水平相当。1980年以来，由于农业害虫危害严重，拟除虫菊酯类杀虫剂被广泛应用于农业害虫的防治。其他杀虫剂如氨基甲酸酯和有机磷，自1990年以来也在该地被使用。骚扰库蚊一般生长在地下水系中，其与杀虫剂接触的机会可能因栖息环境类型而与淡色库蚊不同。本次实验结果与2015年济宁城区淡色库蚊抗药性[22]相比，拟除虫菊酯类抗性水平下降，但残杀威和DDVP的抗性水平有所上升。与同期淡色库蚊抗性相比，骚扰库蚊残杀威和DDVP的抗性水平也较高，但溴氰菊酯和氯氰菊酯抗性水平相当[23]。杀虫剂的使用在蚊虫综合治理和蚊媒疾病控制中做出了巨大贡献，化学杀虫剂使用方便，杀灭效果快，作用强且持久，但易产生环境污染和使蚊虫产生抗药性问题。Bti作为生物杀虫剂，因其对环境友好，不易使蚊虫产生交互抗性和对蚊幼杀灭作用显著从而使用频率和范围逐渐增大。本次研究结果显示，骚扰库蚊对Bti为敏感水平，在未来控制骚扰库蚊孳生地时可以优先使用该种杀虫剂以达到较好的灭蚊幼效果。

城市化发展的过程中，蚊虫的分布、种类和密度也将发生变化。骚扰库蚊与城市环境密切相关，随着该物种在越来越多的地区被发现，我们有必要对该物种的生物学特点和抗药性水平进行深入了解，特别是作为蚊媒疾病载体的研究有助于评估该种蚊虫潜在的流行病学意义。对于骚扰库蚊在内的尖音库蚊复合组的吸血习性的研究，可以揭示引起吸血性和非吸血性蚊虫的关键差异点，为研发新型高效杀虫剂提供理论依据。针对于目前的情况我们提出以下几点建议： 1)骚扰库蚊防治以综合治理为主，针对于该蚊易栖息的封闭或半封闭场所加强环境整治，减少孳生地。2)加强蚊媒监测，根据当地蚊媒疾病发生和流行的特点，分析可能传播的蚊媒疾病并有针对性地控制蚊虫密度，从而制定科学、合理、有效的防治措施。3)孳生地通过采用生物杀虫剂或生物防治的方法可以减缓蚊虫抗药性的发展。

利益冲突：无