海南省西部地区莱姆病血清学调查

朱 雄，侯学霞，于 莉，张 琳，陈运优，苗广青，陈 婷，郝 琴，何吕芬

莱姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi, BB) 感染引起的，一种由媒介蜱传播的自然疫源性人兽共患病。1982年，Burgdorferi W等[1]首次从肩突硬蜱体内成功分离出螺旋体，螺旋体感染通常是开始于肩突硬蜱幼虫阶段，主要以哺乳动物为宿主，积聚于宿主中肠。病原体进入机体后早期表现为皮肤游走性红斑、流感样症状、关节痛、肌肉痛、胸痛等症状，晚期可表现为面神经炎、脑膜炎、面神经麻痹、肢体麻木等神经系统受损[2-3]。莱姆病在美国称为第二“艾滋病”,被列为世界性公共卫生问题[4]。目前，莱姆病在亚洲、欧洲、美洲、大洋洲、非洲等 70多个国家均有报道，分布广泛[5]。莱姆病在我国30个省、市、自治区都有过相关报道，主要集中在东北林区，南方许多省份也有报道[6]。有学者已证实海南三亚存在莱姆病病原体感染[7-8]。然而莱姆病在海南西部地区的分布情况不明确，因此，本文通过对海南西部地区的关节炎或神经症状病患者开展莱姆病血清流行病学调查研究，了解海南省西部地区莱姆病感染状况。

1 材料与方法

1.1血清样本的收集 2015年08月30日至11月30 日，从东方市人民医院收集400份血清，儋州市人民医院收集500份血清。所有血清均来源于患有关节炎症状或神经系统症状患者，均排除风湿性关节炎等其他疾病。

1.2主要试剂 羊抗人IgM和IgG荧光抗体、HRP标记的羊抗人IgM 和SPA，均购自美国Sigma公司。莱姆病抗原片和WB膜条由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所莱姆病室提供。

1.3 莱姆病抗体检测

1.3.1间接免疫荧光实验(IFA) 将血清用3%卵黄液从1∶16开始倍比稀释，在荧光显微镜40×10视野下,50%以上螺旋体染上明亮荧光，抗体效价IgM≥1∶64,IgG≥1∶128为阳性。同时做阳性、阴性对照。

1.3.2蛋白免疫印迹法(WB) 将IFA初筛的阳性标本用WB进一步检测。用PBS-T以1∶25稀释血清并浸泡抗原条，震荡4 h，洗脱3～5次，每次5～10 min，将抗原条分别加入二抗IgG或IgM，过夜。再经过洗脱5次，每次5～10 min，加入显色剂显色30 min。显色结束，用纯水终止反应。WB结果根据中国莱姆病WB诊断标准进行判定[9-10]，当OspA、OspB、OspC、14 kD、17 kD、28 kD、30 kD、39 kD、58 kD、66 kD、83/100 kD中至少有一条蛋白显色即可诊断IgG阳性；OspA、OspB、OspC、14 kD、17 kD、30 kD、39 kD、58 kD、83/100 kD中至少有一条蛋白带显色可诊断IgM阳性；如果是41 kD显色，须进一步作梅毒螺旋体和钩体鉴别诊断。

1.4统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料以率表示， 采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1莱姆病血清学抗体检测结果 利用IFA方法检测血清样本900份，35份阳性，其中IgG阳性 28份，IgM 阳性共10份，有3份样本的IgG和IgM同时为阳性。这次调查结果显示，海南省西部地区关节炎或神经性疾病患者的莱姆病的IFA阳性率为3.89%(见表1)。对IFA 检测阳性的35份血清样本进一步用 WB方法确认，结果显示共有15份 WB检测阳性， 其中IgG阳性10份， IgM 阳性8份，有3份样本的IgG和IgM同时为阳性(见表2)。

2.2不同性别人群感染状况 所有调查对象中, IFA方法检测男性血清莱姆病总抗体阳性率4.33%，高于女性的3.52%(见表3)，但差异无统计学意义(χ2=0.389，P=0.533)。经IFA和WB两步法检测男性血清莱姆病总抗体阳性率1.68%，女性血清莱姆病总抗体阳性率1.66%(见表3)，差异无统计学意义(χ2=0.001，P=0.975)。

2.3不同年龄人群莱姆病感染情况 所有调查对象中,所有年龄组均检出阳性者， 血清莱姆病抗体阳性标本的患者年龄跨度为5～85岁。其中，IFA方法检测结果，≤20岁为4人,阳性率最高，为11.76%(4/34),21～40岁次之，阳性率为8.60%(8/93)，41～60岁、61～80岁和≥81岁阳性率分别为1.85%(5/271)、4.21%(15/356)、2.40%(3/125)，另有21份样本无年龄报告(见表4)。以上人群的感染率，差异有统计学意义(χ2=14.684，P=0.005)。IFA和WB两种方法检测结果，≤20岁、21～40岁、41～60岁、61～80岁和≥81岁阳性率分别为11.76%(4/34)、3.23%(3/93)、0.74%(2/271)、1.40%(5/356)和0.80%(1/125)，不同年龄人群莱姆病感染率差异有统计学意义(χ2=24.108，P<0.001)。见图1。

表1 海南西部地区莱姆病血清学抗体检测结果
Tab.1 Serological antibody detection of Lyme disease in Western areas of Hainan Province

抗体类型检测数IFA法阳性数阳性率(%)IgG900283.11IgM900101.11IgG和IgM90030.33IgG和(或)IgM900353.89

表2 35例IFA阳性标本的 WB检测结果
Tab.2 Results of WB detection in 35 IFA positive samples

序号性别年龄首诊症状IgG(+)IgM(+)1女5神经症状33 kD37,39 kD2男8神经症状37,39 kD-3男12神经症状37,39 kD-4男13神经症状-39 kD5女59神经症状37,39 kD-6女28神经症状-33 kD7女30关节症状39 kD-8男33关节症状39 kD39 kD9男63神经症状37,39 kD-10男63关节症状39 kD-11女68关节症状-66 kD12男68关节症状31 kD31 kD、28 kD13女57关节症状-83-100 kD14女73关节症状39 kD-15女85关节症状-36 kD

表3 不同性别人群血清莱姆病抗体检测结果
Tab.3 Results of serum antibody of Lyme disease in different sex groups

性别检测数IFA法WB法阳性数阳性率(%)阳性数阳性率(%)男416184.3371.68 女483173.5281.66 不详100.0000.00

2.4不同症状患者莱姆病感染情况 对不同症状人群莱姆病血清抗体检测结果显示, IFA方法检测关节症状患者莱姆病总抗体阳性率4.47%，略高于神经症状的阳性率3.19%(见表5)，但差异无统计学意义(χ2=0.986，P=0.321)。IFA和WB两种方法检测关节症状患者莱姆病总抗体阳性率1.63%，略低于神经症状的阳性率1.72%(见表5)，但差异无统计学意义(χ2=0.011，P=0.917)。

表4 不同年龄人群血清莱姆病抗体检测结果
Tab.4 Results of serum antibody of Lyme disease in different age groups

年龄组检测数IFA法WB法阳性数阳性率(%)阳性数阳性率(%)≤2034411.76 411.76 21～409388.60 33.23 41～6027151.85 20.74 61～80356154.21 51.40 ≥8112532.40 10.80 不详2100.00 00.00

图1 不同年龄人群血清莱姆病抗体阳性率Fig.1 Positive rate of serum antibody of Lyme disease in different age groups

表5 不同症状患者血清莱姆病IFA检测结果
Tab.5 Results of IFA test in Lyme patients with different symptoms

症状检测数IFA法WB法阳性数阳性率(%)阳性数阳性率(%)关节症状492224.47 81.63 神经症状408133.19 71.72

3 讨 论

莱姆病分布广泛，发病率呈上升趋势，新的疫源地不断发现。在北美洲，莱姆病的疫源地主要分布于东北部、中西部及西部地区。在欧洲，病例主要分布在北欧和中欧地区[5,11]。在亚洲，分布在日本和中国。我国莱姆病的疫区主要集中在东北部、西北部和华北部分地区的林区，分布范围比较广，新疆、黑龙江、吉林等省(自治区) 已有大量莱姆病发病的病例报告，而且大多数地区已经分离出病原体[6,12]。海南省位于中国的最南端，它的自然地理条件与我国莱姆病发生率高的地区差异极大。2011年金玉明等[13]报道了蜱感染疾病。2015—2018年，朱雄等[7-8]对海南省三亚市关节炎和神经症状患者进行血清莱姆病伯氏疏螺旋体抗体筛查，确证海南省存在莱姆病。

本次研究从海南西部地区莱姆病疑似患者血清中检出莱姆病抗体，表明海南省西部地区人群存在莱姆病感染。在关节炎和神经性疾病患者中，IFA法初筛阳性率为3.89%，并通过WB方法确诊莱姆病15例，感染率1.67%，人群总感染率低于2018年三亚地区调查结果[8]。表明在海南省西部地区存在关节炎和神经系统症状的莱姆病患者，提示当地的临床医生对该类患者应考虑是否患莱姆病。

本研究结果表明，900例血清样本中，IFA法检测初筛阳性率为3.89%，而WB法检测阳率为1.67%，IFA法阳性率高于WB法，原因是IFA法与钩端螺旋体、梅毒螺旋体等有交叉反应导致假阳性结果。2010年，Biesiada G[14]研究表明检测莱姆病需要用两步诊断方法(Two-step diagnosis)，即ELISA 或 IFA 法初筛为阳性，且 WB法检测结果为阳性即可确诊，以此来提高诊断的特异性和准确性。但血清学方法检测莱姆病仍存在一些问题。抗B．burgdorferi的IgM 和IgG可长期存在于愈后病人或动物的血液中，无法辨别近期感染和继发感染，所以血清学方法不能作为该病临床疗效的判定标准。

从取样的性别和症状结果分析，不同性别和症状人群均有莱姆病螺旋体感染的发生，但差异无统计学意义。不同性别莱姆病螺旋体感染结果分析与武军元等[15]研究结果一致，而李志清等[16]研究表明陕西省男性莱姆病总感染水平高于女性，王化勇等[17]研究表明北京市密云地区女性莱姆病总感染水平高于男性。

从不同年龄人群莱姆病血清抗体检测结果看, 本次标本IFA和WB法检测≤20岁年龄组的莱姆病感染率居首位, 阳性率为11.76% (4/34),这4例阳性患者均有神经症状；21～40岁年龄组次之，61～80岁年龄组居第3位。陕西省61～70岁年龄组人群莱姆病血清抗体阳性率最高[16]。新疆喀什市20～50 岁人群的感染率明显高于 20岁以下和 50岁上人群的感染率[15]。莱姆病是通过蜱叮咬而感染的一种自然疫源性疾病，不同地区不同年龄组人群自然感染率的高低与蜱暴露的频率及持续时间长短密切相关。

本研究认为海南西部地区存在莱姆病。本研究样品数量有限，虽不能准确反映当地人群莱姆病流行的状况，但是，为海南省莱姆病的防控提供了理论依据。提示当地医务人员在进行临床疾病的诊断中,对神经症状和关节症状的患者，应注意莱姆病的鉴别诊断,做到早发现、早诊断和早治疗,控制并发症的出现。同时,应重视林区工人、护林人员、农民以及青少年儿童的莱姆病知识的普及工作,提高当地人群的防护意识,减少蜱暴露及受蜱的叮咬概率,预防和控制莱姆病的发生与流行。

利益冲突：无