钩端螺旋体EMJH培养基实验室应用

潘敏楠，徐国英

钩端螺旋体病是一种自然疫源性疾病，其宿主多样性，该病世界各地都有散在发生，甚至呈现局部暴发流行。培养和分离钩体对于防治钩体病至关重要[1]。目前，钩体培养基主要为柯氏培养基和EMJH培养基，目前美国BD公司推出改良EMJH培养基[2-3]，配制简单，本文在钩体病防治实践中对这2种培养基进行比较，探讨其应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验菌种 钩体15群15型标准菌株1套，来自中国CDC。

1.1.2培养基 柯氏培养基：按国标配制，加10%灭活兔血清，分装无菌试管中，6 mL/支。EMJH培养基：将BD公司提供的钩体基础EMJH和钩体增菌液配制液体培养基，分装无菌试管中，6 mL/支。

1.1.3血清标本 健康人63 份，近2年临床钩体疑似病人189 份和保存的2008年本省钩体暴发流行病人29 份[4]。

1.2 试验方法

1.2.12种培养基培养钩体生长比较 同时接种0.6 mL钩体菌液(1套钩体标准菌株)于相同体积的2种培养基中，28 ℃培养；每2 d在暗视野显微镜下(10×40)观察生长情况，连续观察3周，结果判定：以+～++++记录钩体生长状况，其每视野下钩体数分别为50～100条(+)、100～200条(++)、200～400条(+++)、400条以上(++++)。

1.2.2钩体抗体测定:钩体显微镜凝集试验(MAT)同时采用培养6 d的2组钩体标准培养物对不同人群血清标本进行MAT试验，血清预先经56 ℃ 30 min灭活处理后，血清稀释度从1∶50到1∶1 600。结果判定：健康人群血清抗体滴度≥1∶100(++)为阳性，病人单份血清抗体滴度≥1∶400(++)为阳性，比较其检测的敏感性.

2 试验结果

2.1不同培养基培养钩体生长情况 用柯氏培养基培养15群15型钩体，暗视野显微镜下观察各群钩体都能生长，培养第6 d达到高峰(+++)，第14 d菌体密度下降(++以下)，镜下可见杂质和钩体自凝现象。用EMJH培养基培养钩体视野清晰，各菌群生长良好，运动活泼，没有出现自凝现象。培养第2 d就达高峰(+++)，并一直维持到第20 d(+++)。不论是常见流行的黄疸出血群、犬群、秋季群、波摩那群、流感伤寒群、七日热群和巴达维亚群，还是罕见的爪哇群、澳洲群、赛罗群和明尼群等，都是一致的结果。以黄疸出血群钩体为例，见表1。

表1 不同培养基培养黄疸出血群钩体结果
Tab.1 Grow condition of Icterohaemorrhagiae leptospira in different medium

培养时间(d)246810121416182022柯氏培养基+++++++++++++++++++++EMJH培养基++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

2.2不同人群血清钩体显微镜凝集试验(MAT)

2.2.1健康人群血清MAT 63份健康人血清以1∶50稀释度检测抗体，采用上述2种培养基的6 d培养物进行MAT，钩体抗体均阴性。

2.2.2疑似病人血清钩体抗体检测 共收集189份医院送检疑似钩体病人血清，经2种培养基培养后抗体检测结果也完全一致，主要流行的菌群为秋季群、波摩那群、七日热群等，2种培养基的培养物均检出45份阳性血清[≥1∶400(++)]，阳性率23.8%，皆为相同的病人。

2.2.3钩体病暴发流行病人血清抗体检测 从本省霞浦秋季群钩体病爆发流行收集到29份病人血清[4]，用柯氏培养基培养物进行钩体MAT，4份阴性、8份1∶400阳性、14份1∶800阳性、3份1∶1600阳性，用EMJH培养基培养物试验，4份阴性、2份1∶400阳性、13份1∶800阳性、10份1∶1600阳性，抗体效价多数较柯氏培养基培养物至少高一个稀释度，见表2。

表2 2种培养基钩体培养物MAT比较
Tab.2 Antibody titer comparison of MAT test in two kinds of Leptorpira media

检测数血清MAT凝集效价1∶400(-)1∶400 (++)1∶800(++)1∶1600(++)合计χ2P*柯氏培养基48143297.860.0408EMJH培养基42131029

注：*似然比卡方检验，df=3

3 讨 论

2种培养基都适用于培养钩体，但配制柯氏培养基需要添加兔血清，由于兔血清成分复杂，采集过程批次间差异大，用来培养钩体生长不稳定，镜下观察呈杂质多，其钩体培养高峰出现在6～14 d，晚期出现钩体自凝现象。EMJH培养基改用BSA替代兔血清，配方也有调整，制备简便，发现有助钩体生长，钩体形态正常运动活泼，镜下清晰并无自凝现象，培养第2 d观察到大量钩体菌，并且其密度维持到第20 d。尽早分离培养到钩体菌在钩体病流行病学调查中与检测中十分重要，这为早期防治钩体病提供科学依据。在钩体阳性血清验证试验中，由于血清保存时间长(10年前的病人血清)，抗体效价有所下降，EMJH培养基培养的钩体MAT试验同样都测出抗体，但多数较柯氏培养基培养菌效价高，说明EMJH培养基培养菌有较高的抗原性。BD公司生产的EMJH培养基完全可用于快速分离钩体，有利早期确定钩体病的流行和实验室研究。

利益冲突：无