G10631A和C521T基因多态性与脑梗死相关性

杜家琇 杨冬冬 赵 萌 张淑玲

郑州人民医院神经内科，河南 郑州 450003

脑梗死是最常见的脑血管疾病，是由于脑组织急性缺血而引起的神经功能障碍，大多数突然发病，病情进展快，致残致死率高。近年来，发病率呈上升趋势，占全部脑卒中的60%～80%，已成为严重威胁中老年人生命健康的主要疾病之一[1-3]。过去数十年，通过对脑血管病危险因素的研究及预防使脑梗死的发病率及病死率明显有所下降，但其发病率存在个体差异的原因及动脉粥样硬化形成的病理生理机制仍不明确。

家族遗传史是脑血管疾病重要的不可控因素之一，随着分子遗传学技术的进步，脑梗死发病机制相关基因遗传学研究也日益受到关注[3-4]，寻找脑梗死疾病的相关致病基因成为新兴的研究热点。国内外大量的研究表明，肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)系统激活在高血压、高血脂、冠心病的发生、发展过程中起着重要作用[5-6]，而RAS多态性参可能参与动脉粥样硬化形成全过程的调节，RAS基因多态性增加动脉粥样硬化、心血管疾病的风险，其与高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心血管系统疾病相关性的研究已较多，但RAS基因多态性与脑梗死相关性的研究较少[7-8]。

本研究采用酚/氯仿法提取DNA，限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP)分析法检测G10631A和G521T的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，旨在探讨肾素基因G10631A及血管紧张素基因C521T的单核苷酸多态性及单体型与脑梗死的相关性，以期从遗传基因水平为脑梗死易感者的早期识别与筛查提供理论依据。

1 资料与方法

1．1一般资料选择2016-05—2019-05月郑州市人民医院神经内科收治的脑梗死患者为研究对象，病例纳入标准：(1)符合脑梗死诊断标准，并经CT、磁共振成像检查确诊为脑梗死；(2)患者之间无血缘关系；(3)病历资料完整。排除标准：并发其他类型脑血管疾病、血液系统疾病、肿瘤、颅内感染、自身免疫性疾病及严重肝、肾功能不全者。该研究共纳入脑梗死患者100例(脑梗死组)，男70例，女30例；年龄35～80(59.5±10.2)岁，病程1～90(45.4±7.8)d。另选择同期健康志愿者作为对照，纳入标准：(1)身体健康，资料信息完善；(2)既往无肿瘤、脑血管疾病、慢严重代谢性疾病史；(3)受试者之间无血缘关系。该研究共纳入健康志愿者100例，男68例，女32例，年龄34～80(60.1±10.5)岁。

1．2主要试剂与仪器A200型快速PCR仪(上海般诺生物科技)；Cosmo Bio 新型精简琼脂糖凝胶核酸电泳仪(Cosmo Bio公司生产)；扩增引物(赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产)；FastDigest快速限制性内切酶(赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产)。

1．3G10631A和C521T基因多态性检测采集2组受试者空腹静脉血，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，置于-70 ℃ 冰箱保存，以备 DNA 提取。采用酚/氯仿法提取DNA，限制性片段长度多态性分析(PCR-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP)法检测G10631A和G521T的SNP。G10631A的引物设计参照FRPSSARD等[9-10]的研究，上游引物序列为5'-TGAGGTCGAGTCGGCCCCCT-3'，下游引物序列为5'-TGCCCAAACATGGCCACACAT-3'。C521T的引物设计参照CAULFIELD等[11-12]的研究，上游引物序列为5'-GATGCGCACAAGGTCCTG-3'，下游引物序列为5'-CAGGGTGCTGTCCACACTGGCTCGC-3'。PCR-RFLP操作流程如下：取用已制备好的模板DNA 1.8 μL加入PCR反应混悬液中，混匀，液态石蜡封顶；然后进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重复35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取G10631A扩增产物10 μ0，加入内切酶MboⅠ 10 U、100 U酶A环顶TGTμ0，混匀，37℃下反应16 h后终止。取G521T扩增产物10 μ0，加入内切酶NcoⅠ 10 U、100 U酶A环顶TGTCCμ0，混匀，37 ℃下反应4 h后终止。反应后产物均行20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳基因分型。G10631A基因PCR扩增后产物为250 bp DNA片段，酶切反应后若出现171 bp和79 bp条带则为AA型；若出现250 bp、171 bp和79 bp条带则为GA型，若出现250 bp和79 bp条带则为GG型。G521T基因PCR扩增后产物为303 bp DNA片段，若出现211 bp和92 bp条带则为TT型，若出现303 bp、211 bp和92 bp条带则为CT型；若只出现303 bp条带则为CC型。

1．4统计学处理采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。采用基因计数法计算G10631A和C521T基因型与等位基因频率，2组基因型及等位基因频率比较采用χ2检验；采用Logistic回归分析G10631A、C521T基因多态性与脑梗死患病风险的相关性，采用Shesis软件计算G10631 A和C521 T的单体型频率；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．12组受试者G10631A基因型及等位基因频率比较结果见表1。脑梗死组患者G10631A的AA基因型及A等位基因频率均高于对照组，差异有统计学意义(χ2=8.672、10.172，P<0.05)。

2．22组受试者C521T基因型及等位基因频率比较结果见表2。脑梗死组患者C521T的TT基因型及T等位基因频率均高于对照组，差异有统计学意义(χ2=8.665、22.118，P<0.05)。

2．3G10631A和C521T基因型与脑梗死患病风险的相关性结果见表3。G10631A的AA基因型、C521T的TT基因型可增加脑梗死发生率(OR=2.039、2.031，P<0.05)。

表1 2组受试者G10631A基因型及等位基因频率比较 [n(%)]

表2 2组受试者C521T基因型及等位基因频率比较 [n(%)]

表3 G10631A和C521T基因型与脑梗死患病风险的相关性

2．4G10631A和C521T的单倍型与脑梗死患病风险的相关性结果见表4。G10631A与C521T可构建A-C、A-T、G-C及G-T共4个单体型，并以G-C最常见。脑梗死组患者A-T单体型出现频率高于对照组，差异有统计学意义(χ2=16.127，P<0.05)，但脑梗死组G-C单体型出现频率低于对照组，差异有统计学意义(χ2=17.368，P<0.05)。

表4 G10631A和C521T的单倍型频率与脑梗死患病风险的相关性

3 讨论

脑梗死即缺血性卒中，是局部脑组织的血液供应障碍导致的脑组织功能受损及缺氧性坏死。既往研究发现高血压、糖尿病、肥胖、吸烟等代谢相关或不良生活习惯等均为脑梗死发生重要危险因素[13-14]。脑梗死的发病机制尚未完全阐明，但是其可能与动脉粥样硬化过程密切相关，动脉粥样硬化是脑梗死最常见原因[4，15]。RAS系统在高血压疾病形成过程中所起的重要作用已得到很多研究支持[4，16]，但在与高血压密切相关的脑血管病发生、发展中所起的作用并不完全清楚，争论颇多。随着遗传学研究技术手段的进步，探究脑梗死发病相关基因成为可能，RAS系统作为心脑血管的重要调节因素，其与脑梗死的相关性逐渐得到关注[17]。本研究探讨G10631A和C521T基因多态性与中国汉族人群脑梗死发生的关系，从而为脑梗死早期预防提供新的临床上的治疗靶点。

肾素主要通过催化血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ而激活RAS系统，其作为RAS系统的重要组分而备受关注[18-20]。肾素基因位于1q21.3-32.3，全长约12.5kb，包含10个外显子及9个内含子，近些年的研究位点多集中在Bgl Ⅰ(第一内含子)、Mbo Ⅰ(第九内含子)、Hind Ⅲ、Bgl Ⅱ(均位于3’侧链区)和Taq I(位于5’侧链区)等多个限制性片断长度多态性。G10631A属第9内含子中第10631位G(鸟嘌呤)被A(腺嘌呤)替代[21]。FROSSARD等[9]曾在美国人群中研究肾素-血管紧张素系统G10631A基因与卒中的关系，结果发现卒中组AA基因型和A等位基因频率均显著高于对照组(P<0.05)，认为G10631A多态性是卒中的危险因素，该研究结论也在国内的一些研究中得到证实。本研究结果显示，脑梗死组患者G10631A的AA基因型及A等位基因频率均高于对照组(χ2=8.672、10.172，P<0.05)，且G10631A的AA基因型可增加脑梗死发生率，差异有统计学意义(OR=2.039，P<0.05)，提示G10631A的AA基因型及A等位基因可能是脑梗死的易感因素。

人的血管紧张素原基因定位于常染色体1q42-43上，它是一个长度约为12kb的单拷贝基因，包含5个外显子和4个内含子，血管紧张素原基因结构上存在至少16个多态位点，C521T属第2外显子中第521位胞嘧啶被胸腺嘧啶替换[22]，使编码第174位苏氨酸(T)变为蛋氨酸(M)，即C521T突变。国内外关于C521T基因多态性与脑血管疾病的关系研究数量少，目前的研究支持基因C521T多态性与脑梗死存在相关性，但具体的发病机制目前并不清楚。本研究结果显示，脑梗死组患者C521T的TT基因型及T等位基因频率均高于对照组(χ2=8.665、22.118，P<0.05)，且C521T的TT基因型可增加脑梗死发生率，差异有统计学意义(OR=2.031，P<0.05)，提示C521T的TT基因型及T等位基因可能是脑梗死的易感因素，这与有关研究结果基本一致[21]。

单体型是指同一个染色体上多个单核苷酸的组合，即不同基因或同一基因的不同位点在同一条染色体上的组合[22]。单体型可尽可能地减少遗传分析的复杂性，相对单位点基因型来说，单体型可以更精确地预测某一个基因的活性。脑梗死相关的基因位点非常多，而基因间的相互作用以及各种周围环境因素所起的作用不易确定，因此将多个单核苷酸位点进行单体型分析比单位点分析更具有遗传学及临床指导意义。G10631A与C521T可构建A-C、A-T、G-C及G-T共4个单体型，并以G-C最常见，本研究结果显示，脑梗死组患者A-T单体型出现频率高于对照组(χ2=16.127，P<0.05)，但脑梗死组患者G-C单体型出现频率低于对照组(χ2=17.368，P<0.05)，提示A-T单体型可能与脑梗死的发生有关，可能是脑梗死的重要遗传易感因素。

尽管如此，本研究仍存在一些不足，样本量有限，且并未对脑梗死进行分型，而相关基因型与脑血管病众多危险因素之间的关系未能明确，因此有必要进行大样本量来证实G10631和C521T基因多态性与脑梗死相关性。

RAS中G10631A的AA基因型和A等位基因、G521T的TT基因型和T等位基因及A-T单体型可能是脑梗死的遗传易感因素。但是G10631A和C521T基因到底如何影响脑梗死的发病过程，具体机制仍不清楚，研究者一般认为可能通过氧化应激、炎症因子及内皮细胞的作用等影响动脉粥样硬化形成和脑血管疾病的发生、发展，仍需进行大量的更深入的研究。