丹参多糖促进自噬抑制脂多糖诱导心肌细胞凋亡的实验研究

张建成 林淑琴 胡鹏飞

脓毒症是由感染引起的高死亡率全身炎症反应综合征[1]。脂多糖（LPS）诱导的心肌损伤是脓毒症患者死亡的主要原因，病死率高达90%[2-3]。LPS 诱导脓毒症大鼠心肌功能发生障碍，心肌组织氧化水平升高，细胞凋亡增多[4]。自噬作为细胞内降解损伤细胞器、冗余蛋白质的主要方式之一，调控细胞凋亡生理进程[5]。LPS 处理心肌细胞，细胞凋亡及自噬水平显著升高，心肌收缩功能异常[6]。丹参多糖（SMP）是丹参的有效成分，具有免疫调节、抗氧化及抗凋亡等生理功效[7-8]。丹参显著改善缺血再灌注损伤，抑制心肌细胞凋亡，改善心功能[9]。长期口服SMP 增强内源性抗氧化剂和抗高血脂活性，对异丙肾上腺素诱导的大鼠心脏损伤具有显著的保护作用[10]。提示SMP 可能对LPS 诱导的脓毒症心肌细胞损伤有保护作用，但目前尚未见报道。本文通过分离SD 大鼠心肌细胞，探究SMP 对LPS 诱导的心肌细胞损伤的调节机制。

1 实验材料

1.1 动物 12 月龄健康雄性实验清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠20 只，体质量250～300g，浙江省实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK（浙）2018-0012，伦理批号：2018154，动物房保持通风，干燥，室温22～25℃，湿度维持在50%～70%，自由饮水，鼠料定量喂养，动物饲养及实验操作严格遵守实验动物的使用和管理原则。

1.2 试剂 DMEM/F12（Gibco，#12 400024），GAPDH（Cell Signaling Technology，#5174T）、Bax（Cell Signaling Technology，#2772）、Caspase3（Cell Signaling Technology，#9662）、cleaved-Caspase3（Cell Signaling Technology，#9664）、LC3（Cell Signaling Technology，#3868）和Beclin1（Cell Signaling Technology，#3738），CQ（北京华美互利生物化工，#54057），Torin1（碧云天，#SC0245），Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（碧云天，#C1062S），MTT 试剂盒（上海威奥生物有限公司，#WH1197）。

2 实验方法

2.1 SMP 制备 取丹参（广锐生物，#1490）2kg，碾碎呈粉末，加入15 倍量水，20℃下进行搅拌提取，每次0.5h，重复2 次。真空干燥滤液获得SMP。

2.2 大鼠心肌细胞分离与培养 大鼠心肌细胞分离方法参考文献[11]报道。大致过程：取出生1～2 天大鼠心脏，生理盐水（PBS）冲3 次，取心室肌剪碎，含0.125%胰蛋白酶的PBS 消化4 次，每次15min。添加10%胎牛血清终止消化。250g/min，离心8min，加入含10%胎牛血清DMEM/F12 复苏。复苏的细胞在10cm的培养皿中培养12h，使非心肌细胞（主要是心肌成纤维细胞）黏附在塑料上，细胞用含1%溴脱氧尿苷DMEM 培养48h。消化离心收取心肌细胞，-80℃冻存。

2.3 大鼠心肌细胞分组及SMP 处理方法 将大鼠心肌细胞分为五组：对照组、LPS 组、0.5mg/mL SMP干预组、1mg/mL SMP 干预组和2mg/mL SMP 干预组。LPS 组：终浓度1μg/mL LPS 刺激大鼠心肌细胞24h；SMP 干预组：不同浓度SMP 预处理大鼠心肌细胞12h，然后用1μg/mL LPS 刺激24h；对照组：加入等量生理盐水。

2.4 MTT 检测SMP 对心肌细胞活力的影响 5000个心肌细胞种植于96 孔板，分为五组：对照组、LPS组、0.5mg/mL SMP 干预组、1mg/mL SMP 干预组和2mg/mL SMP 干预组。处理24h 后，加入5%MTT，37℃培养箱中孵育1h，分光光度计在450nm 波长下测定细胞吸光度改变，统计存活率，进行3 次独立重复实验。

2.5 流式细胞仪检测SMP 对心肌细胞凋亡的影响心肌细胞种植于6 孔板，分为五组：对照组、LPS 组、0.5mg/mL SMP 干预组、1mg/mL SMP 干预组和2mg/mL SMP 干预组。处理24h 后，胰酶消化制成0.1mL 的含2×105单细胞悬液，预冷的70%乙醇4℃固定2h。离心弃去固定液，3mLPBS 重悬，清洗3 次。1mL PI 染液染色，4℃避光30min。流式细胞仪检测细胞凋亡比例，进行3 次独立重复实验，统计细胞凋亡比例。

2.6 Western blot 检测SMP 处理的心肌细胞自噬及凋亡相关蛋白改变 心肌细胞分为五组：对照组、LPS 组、0.5mg/mL SMP 干预组、1mg/mL SMP 干预组和2mg/mL SMP 干预组。处理24h 后，收集细胞蛋白，BCA 测定蛋白含量，高温加热蛋白变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF），转膜结束后，5%脱脂牛奶封闭常温孵育1h，按一抗浓度Bax（1：10000）、Caspase3（1：1000）、cleaved -Caspase3（1：1000）、LC3（1：5000）、Beclin1（1：5000）和GAPDH（1：10000）孵育一抗，4°C孵育过夜，洗膜液洗3 次，每次15min，二抗浓度（1：10000）孵育2h，洗膜液洗3 次，每次15min，化学发光法（ECL）显影，凝胶成像系统检测Bax、Caspase3、cleaved-Caspase3、LC3 和Beclin1 蛋 白 表 达，以GAPDH 为内参。进行3 次独立重复实验。

2.7 SMP 调控自噬对心肌细胞存活率的影响 将大鼠心肌细胞分为五组：对照组、LPS 组、LPS+2mg/mL SMP 干预组、LPS+2mg/mL SMP+氯喹（CQ）干预组和LPS+2mg/mL SMP+Torin1 干预组。LPS 组：终浓度1μg/mL LPS 刺激大鼠心肌细胞24h；LPS+2mg/mL SMP 干预组：2mg/mL SMP 预处理大鼠心肌细胞12h，然后用1μg/mL LPS 刺激24h；LPS+2mg/mL SMP+CQ 干预组：2mg/mL SMP 和50μM CQ 预处理大鼠心肌细胞12h，然后用1μg/mL LPS 刺激24h；LPS+2mg/mL SMP+Torin1 干预组：2mg/mL SMP 和250nM Torin1 预处理大鼠心肌细胞12h，然后用1μg/mL LPS 刺激24h；对照组：加入等量生理盐水。

2.8 MTT 检测SMP 调控自噬对心肌细胞活力的影响 5000 个心肌细胞种植于96 孔板中，分为五组：对照组、LPS 组、LPS+2mg/mL SMP 干预组、LPS+2 mg/mL SMP+CQ 干预组和LPS+2mg/mL SMP+Torin1干预组。加入5%MTT，37℃培养箱中孵育1h，分光光度计在450nm 波长下测定细胞吸光度改变，统计存活率，进行3 次独立重复实验。

2.9 流式细胞仪检测SMP 调控对心肌细胞凋亡的影响 心肌细胞种植于6 孔板，分为五组：对照组、LPS 组、LPS+2mg/mL SMP 干 预 组、LPS+2mg/mL SMP+CQ 干预组和LPS+2mg/mL SMP+Torin1 干预组。胰酶消化制成0.1mL 的含2×105单细胞悬液，预冷的70%乙醇4℃固定2h。离心弃去固定液，3mL PBS 重悬，清洗3 次。1mL PI 染液染色，4℃避光30min。流式细胞仪检测细胞凋亡比例，进行3 次独立重复实验，统计细胞凋亡比例。

2.10 Western blot 检测SMP 调控自噬对LPS 处理的心肌细胞自噬及凋亡相关蛋白改变 心肌细胞分为五组：对照组、LPS 组、LPS+2mg/mL SMP 干预组、LPS+2mg/mL SMP+CQ 干预组和LPS+2mg/mL SMP+Torin1 干预组。收集细胞蛋白，BCA 测定蛋白含量，高温加热蛋白变性，进行SDS-PAGE，转移到PVDF，转膜结束后，5%脱脂牛奶封闭常温孵育1h，按一抗浓度Bax（1：10000）、Caspase3（1：1000）、cleaved-Caspase3（1：1000）、LC3（1：5000）、Beclin1（1：5000）和GAPDH（1：10000）孵育一抗，4°C 孵育过夜，洗膜液洗3 次，每次15min，二抗浓度（1：10000）孵育2h，洗膜液洗3 次，每次15min，ECL 显影，凝胶成像系统检 测Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3、LC3 和Beclin1 蛋白表达，以GAPDH 为内参。进行3 次独立重复实验。

2.11 统计学方法 应用SPSS 19.0 软件进行统计分析，所有实验重复3 次，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析和t 检验比较组间差异。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 SMP 对LPS 诱导的心肌细胞存活率的影响 与对照组比较，LPS 处理的心肌细胞活力显著降低（P＜0.01）；与LPS 组比较，SMP 预处理显著抑制LPS 诱导的心肌细胞活力降低，且随着SMP 浓度增大，细胞活力显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

3.2 SMP 对LPS 诱导的心肌细胞凋亡的影响 与对照组比较，LPS 处理心肌细胞，细胞凋亡比例显著升高（P＜0.01），与LPS 组比较，SMP 预处理显著抑制LPS 诱导的心肌细胞凋亡，且随着SMP 浓度增大，细胞凋亡比例显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见表2、图1。

表1 SMP 对LPS 处理的心肌细胞存活率的影响（%，±s）

表1 SMP 对LPS 处理的心肌细胞存活率的影响（%，±s）

注：n=3 代表3 次独立重复实验；LPS 为脂多糖；SMP 为丹参多糖；与对照组比较，aaP＜0.01；与LPS 组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

表2 SMP 对LPS 诱导心肌细胞凋亡率的影响（%，±s）

表2 SMP 对LPS 诱导心肌细胞凋亡率的影响（%，±s）

注：n=3 代表3 次独立重复实验；LPS 为脂多糖；SMP 为丹参多糖；与对照组比较，aP＜0.01；与LPS 组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.3 SMP 对LPS 处理的心肌细胞自噬和凋亡蛋白表达的影响 与对照组比较，LPS 处理心肌细胞，细胞促凋亡相关蛋白Bax 和Cleaved-Caspase3 表达增多，自噬相关蛋白Beclin1 和LC3II 蛋白表达增多，表明LPS 诱导心肌细胞自噬。与LPS 组比较，SMP 预处理显著抑制LPS 诱导的心肌细胞Bax 和Cleaved-Caspase3 蛋白表达，促进Beclin1 和LC3II 蛋白表达进一步增加，表明SMP 可能参与LPS 诱导的自噬和凋亡途径，见图2。

图1 SMP 抑制LPS 诱导的心肌细胞凋亡

图2 SMP 对LPS 诱导的心肌细胞自噬和凋亡蛋白表达的影响

3.4 SMP 促进自噬抑制LPS 诱导的心肌细胞活力下降和细胞凋亡 与对照组比较，LPS 处理心肌细胞后，细胞活力明显降低（P＜0.01）；SMP+LPS 组比较，SMP+CQ+LPS 组细胞活力下降，SMP+Torin1+LPS组细胞活力升高（P 均＜0.01）；流式结果表明，与SMP+LPS 组比较，SMP+CQ+LPS 组细胞凋亡增多，SMP+Torin1+LPS 组细胞凋亡减少（P 均＜0.05）。见表3～4、图3。

表3 SMP 促进自噬抑制LPS 诱导细胞活力（%，±s）

表3 SMP 促进自噬抑制LPS 诱导细胞活力（%，±s）

注：n=3 代表3 次独立重复实验；LPS 为脂多糖；SMP 为丹参多糖；CQ为氯喹；与对照组比较，aaP＜0.01；与LPS 组比较，bbP＜0.01；与SMP+LPS 组比较，cP＜0.05

表4 SMP 促进自噬抑制LPS 诱导的细胞凋亡率（%，±s）

表4 SMP 促进自噬抑制LPS 诱导的细胞凋亡率（%，±s）

注：n=3 代表3 次独立重复实验；LPS 为脂多糖；SMP 为丹参多糖；CQ为氯喹；与对照组比较，aaP＜0.01；与LPS 组比较，bbP＜0.01；与SMP+LPS 组比较，cP＜0.05

3.5 SMP 促进自噬抑制LPS 诱导的心肌细胞促凋亡蛋白表达 与SMP+LPS 组比较，SMP+CQ+LPS 组Bax、cleaved-Caspase3 和LC3II 表达增多，Beclin1 表达减少，SMP+Torin1+LPS 组，Bax、cleaved-Caspase3、LC3II 和Beclin1 表达增多，表明SMP 促进自噬抑制LPS 诱导的心肌细胞促凋亡蛋白表达。见图4。

图3 SMP 促进自噬抑制LPS 诱导的细胞凋亡

图4 SMP 调控自噬参与LPS 诱导的细胞凋亡

4 讨论

心肌损伤作为脓毒症的重要病征，导致多器官衰竭。LPS 诱导的脓毒症小鼠发生心肌缺血损伤，促凋亡蛋白表达增多[12]。自噬作为机体重要生理过程，在脓毒症心肌损伤中发挥重要功能。心肌细胞自噬升高减轻心肌梗死引起的心肌损伤，增强心肌细胞自噬对心肌细胞线粒体损伤有保护作用。米诺环素通过增强心肌细胞线粒体自噬和心肌细胞自噬，改善心肌功能[13]。LPS 处理肺上皮细胞，自噬水平随着LPS 处理时间的延长，显著增加[14]。我们前期研究发现，LPS 处理心肌细胞，细胞自噬及凋亡水平显著升高，表现为自噬相关蛋白表达增加，凋亡细胞比例增多，细胞活力下降。

SMP 作为丹参的主要成分，现已广泛应用于免疫性肝损伤、肿瘤及高血压等疾病研究[15-16]。经SMP预处理后，暴露于H2O2的大鼠心肌细胞H9C2 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性下降，丙二醛（MDA）升高，抑制线粒体功能障碍、增强抗氧化和抗凋亡能力[17]。本研究发现大鼠心肌细胞经SMP 预处理，LPS 诱导的细胞凋亡减少，细胞活力升高，促凋亡蛋白表达减少，同时伴随自噬水平升高。另一方面，我们通过自噬抑制剂或激活剂联合SMP 预处理LPS 诱导的心肌细胞损伤模型，发现SMP 促进自噬抑制LPS 诱导的心肌细胞损伤。

综上所述，LPS 诱导脓毒症心肌细胞发生严重的细胞凋亡，导致心肌损伤加重。SMP 通过增强自噬抑制LPS 诱导的心肌细胞损伤，发挥心肌保护作用。