超高效液相色谱-串联质谱法测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白

陈柔含,古淑青,赵超敏,霍忆慧,钮 冰,邓晓军

(1. 上海大学生命科学学院食品工程系, 上海 200436;2. 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心, 上海 200135)

乳铁蛋白是大分子非血红素铁结合糖蛋白,普遍存在于哺乳动物中,分子量为80 kDa,对铁具有高度亲和力,还可以结合Cu2+、Zn2+和Mn2+等金属阳离子[1]。牛乳铁蛋白具有广谱抗菌性、免疫调节性、抗癌性等生物活性[2-5],大量存在于牛初乳中(含量约7 g/L),有“奶黄金”之称。研究发现,牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白在蛋白结构和氨基酸序列上具有高度相似性,易被婴幼儿吸收,越来越多的婴幼儿配方奶粉添加了牛乳铁蛋白以取代人乳铁蛋白,以改善免疫力[6]。

2012年《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》将其列为食品营养强化剂,并明确规定乳制品及婴幼儿配方食品中最高使用量均不得超过1.0 g/kg[7],但目前乳制品中乳铁蛋白的检测还缺乏标准方法。根据现有文献报道,乳铁蛋白检测方法主要有酶联免疫技术(ELISA)[8]、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[9]、电化学技术[10]、液相色谱法[11-15]及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[16-18]等。ELISA尽管操作简单,但灵敏度低,存在交叉反应;SDS-PAGE是蛋白分析常用的电泳法,耗时长,重现性较差;电化学技术简便、快速、灵敏,但易受外界环境因素影响;液相色谱法采用肝素亲和柱纯化蛋白后进行液相检测,结果准确,但价格昂贵,可重复利用次数少。乳制品尤其是奶粉作为复杂基质,采用LC-MS/MS分析具有很大的分析优势,既包含了液相色谱的分离,又能通过质谱精确确证,在乳铁蛋白检测中得到了广泛应用。Zhang等[16]筛选出2个特征肽段,选用合成LRPVAAEIYGTK作标准曲线,同位素标记定量法定量,但该方法定量限较高(10 mg/kg)。Yuan等[17]基于特征肽ETTVFENLPEK定量牛乳铁蛋白,经初级局部序列搜索工具(basic local alignment search tool, BLAST, http://www.uniprot.org/blast/)表明该肽段非牛乳铁蛋白特征肽段,其还存在于羊奶中。Chen等[18]结合超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和毛细管电泳电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱两种方法检测牛乳铁蛋白肽段,有效展现了乳铁蛋白序列,对特征肽段的搜寻提供一定帮助,但未进行乳铁蛋白的定量研究。

本文采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q/Exactive-HRMS)筛选出牛乳铁蛋白的8个特征肽段,并选择其中3个特征肽段通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QqQ-MS),建立乳和乳制品中牛乳铁蛋白的多反应监测(MRM)定量方法,同时考察了空白基质匹配的非标记定量法和标记定量法对乳铁蛋白检测结果的差异。该方法抗干扰能力强,灵敏度高,重复性好,适用于液态乳、婴幼儿配方奶粉等乳及乳制品中牛乳铁蛋白的含量测定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱(Dionex UltiMate 3000)-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用仪(Q-Exactive)(Thermo Fisher,美国);液相色谱(NEXERA X2, LC-30AD)、三重四极杆质谱联用仪(MS8060)(Shimadzu,日本);高效液相色谱仪(Agilent 1290, Agilent,美国);离心机(Allegra X-22R, Beckman Coulter,美国);高速振荡机(CM1000, Eyela,日本);水浴锅(SW22, Julabo,德国)。所有实验用水由Milli-Q超纯水系统(Millipore,美国)制得。

碳酸氢铵(纯度≥99%)、二硫苏糖醇(DTT,纯度≥99%)、碘代乙酰胺(IAA,纯度≥99%)、氯化钙(CaCl2,纯度≥99%)(Sigma,美国);牛胰蛋白酶(测序级,Promega,美国);甲酸(纯度≥98%)(Fluka,美国)。牛乳铁蛋白(纯度≥95%)(Fujifilm Wako,日本),取0.002 g溶于10 mL水中,配制成200 μg/mL标准储备液;内标肽段SF(13C9、15N)QLFGSPPGQR(上海吉尔生化有限公司)用水配制成质量浓度为50 μg/mL的内标标准工作液。奶粉、液态奶、酸奶均为市售。

低蛋白吸附枪头(0.1 mL/1 mL, Brand,德国);低蛋白吸附离心管(1.5 mL, Eppendorf,德国);低蛋白吸附进样瓶、低蛋白吸附衬管(CNW,德国);低蛋白吸附滤膜(0.22 μm, Agela,美国)。

1.2 实验条件

1.2.1样品前处理

脱脂:称取1 g(精确至0.01 g)奶粉样品,置于50 mL离心管中,用水定容至50 mL,涡旋摇匀,于-20 ℃冰箱冷冻10 min后,以10 000 r/min高速离心5 min,除去上层脂质,即得到脱脂奶。

表 1 牛乳铁蛋白特征肽段及MRM参数

CE: collision energy; * quantitative ion.

酶解:吸取200 μL脱脂奶,置于1.5 mL低蛋白吸附离心管中,加入150 μL 500 mmol/L的碳酸氢铵溶液,混匀,然后加入10 μL 500 mmol/L的DTT溶液,混匀,于75 ℃恒温水浴0.5 h;冷却至室温,加入30 μL 500 mmol/L的IAA溶液,暗处静置0.5 h,加入10 μL 100 mmol/L的氯化钙溶液和20 μL 100 μg/mL的牛胰蛋白酶溶液,混匀后置于37 ℃恒温水浴酶解过夜(≥16 h),最后加入10 μL甲酸终止反应,静置15 min,用水定容至1 mL,过0.22 μm低蛋白吸附滤膜,待检测。

1.2.2UPLC-Q/Exactive-HRMS条件

采用Aeris PEPTIDE XB-C18反相色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Phenomenex,美国);柱温:35 ℃;流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,流动相B为0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:0.2 mL/min。洗脱梯度程序:0～4 min, 97%A; 4～29 min, 97%A～40%A; 29～30 min, 40%A～10%A, 30～34 min, 10%A; 34～35 min, 10%A～97%A; 35～40 min, 97%A。进样体积:5 μL。

离子源:电喷雾电离(ESI)源,正离子模式;保护气压力:206.85 kPa;辅助气压力:68.95 kPa;喷嘴电压:3.5 kPa;毛细管温度:320 ℃;辅助气温度:250 ℃;全扫描模式;扫描范围:m/z100～1 500;分辨率:35 000。筛选得到牛乳铁蛋白的8个特征肽段,其质谱参数见表1。

1.2.3UPLC-QqQ-MS条件

色谱柱和流动性条件如1.2.2节所述。柱温:40 ℃;流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0～2.0 min, 95%A; 2.0～14.0 min, 95%A～55%A; 14.0～17.0 min, 55%A; 17.0～17.1 min, 55%A～95%A; 17.1～20.0 min, 95%A。进样体积:10 μL。

离子源:ESI源,正离子模式;离子源接口温度:350 ℃;接口电压:2.0 kV;加热气:空气,12 L/min;雾化气:氮气,3 L/min;干燥气:氮气,8 L/min;碰撞气:氩气;脱溶剂管(desolvation line, DL)温度:200 ℃;加热模块温度:400 ℃;制冷气温度:15 ℃。

2 结果与讨论

2.1 特征肽段选择

基于超高效液相色谱-串联质谱技术的蛋白质组学分析,特征肽段的选择是关键的一步,关系到蛋白质的定性和定量检测[19]。随着基因组学和蛋白质组学的发展,牛乳铁蛋白的氨基酸序列已被广泛研究。利用Skyline软件对牛乳铁蛋白的氨基酸序列进行模拟酶切,得到一系列理论酶切肽段,上述肽段经BLAST搜索得到理论特征肽段。将酶解后的样品在UPLC-Q/Exactive-HRMS平台的数据依赖型全扫(Full MS/data-dependent MS2)模式下全扫描,通过Protein Pilot软件(Version 5.0, AB SCIEX)对特征肽段进行鉴定和筛选,排除含有错切或漏切位点,以及含有甲硫氨酸、NXS/T的糖基化基序和易成环易氧化的肽段序列,优先选择没有任何修饰的肽段以确保特征肽段的稳定性,再结合质谱检测灵敏度高等选择原则[20,21],共筛选出牛乳铁蛋白的8条特征肽段。

将采集的数据和特征肽段理论碎片的匹配度进行验证。多肽在二级质谱中,母离子与惰性气体碰撞,使得肽链中的肽键断裂形成一系列子离子,主要为N端碎片离子(b离子)和C端碎片离子(y离子),碰撞后得到的碎片离子峰和理论碎片峰匹配度高,则表明该肽段的可信度高,更适合于后续的MRM定量分析。经Protein Pilot软件分析鉴定出8个特征肽段具有较好匹配度,以3个响应最高的肽段ESPQTHYYAVAVVK(ESP)、SFQLFGSPPGQ(SFQ)、LRPVAAEIYGTK(LRP)为例(见图1),结果显示,理论y离子(红线)和b离子(绿线)的碎片峰与实验获得碎片峰(蓝线)重合,肽段ESP的28个理论y、b离子碎片中有20个碎片峰得到鉴定,肽段SFQ的22个理论y、b离子碎片中有15个碎片峰得到鉴定,肽段LRP的24个理论y、b离子碎片中有18个碎片峰得到鉴定,表明实验结果与理论碎裂模式高度匹配。

由于实际样品在加工中,常常经历加热、蒸煮或烘烤等过程,易使蛋白质发生多种副反应,影响定性定量结果。为考察特征肽段在实际样品检测中的适用性,将8个特征肽段导入Skyline软件,采用MRM技术对多种不同的实际样品进行检测验证,结果表明,这8个特征肽段均具有良好稳定性和重复性。8个特征肽段氨基酸序列及在乳铁蛋白中所处的位置、保留时间和碎片离子参数如表1所示,提取离子流色谱图见图2。选取3个响应值较高的肽段ESP、SFQ、LRP,每个肽段选择3个干扰最少、响应最高的子离子进行后续的定量分析。

图 2 牛乳铁蛋白特征肽段的提取离子色谱图Fig. 2 Extracted ion chromatograms of marker peptides of bovine lactoferrin

2.2 质谱条件选择

采用MRM技术定量检测目标肽段具有较高的准确性和稳定性,但改变质谱条件对目标物质的响应强度有较大影响,因此需要对质谱条件进行优化,以提高检测灵敏度和稳定性。针对3个特征肽段进行优化,主要考察了气流量、DL温度、离子源接口温度、接口电压、碰撞能量对响应强度的影响。

利用岛津LC-MS/MS自带的Interface软件,考察了雾化气、加热气、干燥气、DL温度及离子源接口温度对离子响应强度的影响。以SFQLFGSPPGQR为例,将雾化气(2.5、3.0)、加热气(8.0、10.0、12.0)和干燥气(8.0、10.0、12.0)的气流量采用交叉组合的优化方式,生成的12组条件见图3a。结果表明,当雾化气、加热气和干燥气流量分别为3.0、12.0和8.0 L/min时,各子离子响应强度最高。DL温度(200 ℃和250 ℃)和离子源接口温度(250、300和350 ℃)两两组合生成6组条件(见图3b),当DL温度和离子源接口温度分为200 ℃和350 ℃时,对应子离子响应强度最高。

图 3 牛乳铁蛋白特征肽段SFQLFGSPPGQR的质谱条件优化结果Fig. 3 Optimization results of mass spectrometry conditions of the SFQLFGSPPGQR peptide of bovine lactoferrin a. nebulizing, heating, and drying gas flow rates; b. desolvation line (DL) and interface temperatures; c. interface voltage; d. collision energy.

ESI源接口电压大小同样影响肽段的电离和带电情况,从而导致检测信号强弱和有无,分别考察了接口电压为0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 kV时离子的响应强度,结果表明当接口电压为2.0 kV时,响应最高(见图3c)。

子离子是由母离子在碰撞室经氩气碰撞后产生的碎片,每个子离子都有一个最优的碰撞能,利用Skyline软件生成优化碰撞能方法,以SFQ为例,对离子通路m/z660.838 4>554.304 5分别施加如图3d所示的11个不同碰撞能,结果表明,碰撞能22.9 eV下可获得最大峰面积。其他特征肽段的MRM参数及优化后的碰撞能见表1。

2.3 样品前处理条件的选择

前处理包括提取乳铁蛋白及酶解,拟定两个步骤(脱脂和除酪蛋白)处理奶粉样品。乳制品中含有大量脂肪,油脂包裹住蛋白质影响酶与蛋白质接触,影响酶解和质谱分析,除脂是必要步骤。酪蛋白在乳制品中约占78%[11],而牛乳铁蛋白占比较低,推测其对检测有一定干扰。

本研究对比冷冻离心和采用正己烷、氯仿-三氟乙酸(4∶1, v/v)时肽段的响应值(见图4)。结果表明,脱脂后响应增强,采用冷冻离心方法除去上层脂质,酶解得到肽段响应值最高,损失最少,故采用该方法。冷冻离心方式无需有机试剂,环境友好;正己烷会和乳制品产生乳化现象难以分离;氯仿-三氟乙酸(4∶1, v/v)处理乳制品,可能由于复溶过程未完全溶解造成损失。

图 4 不同脱脂方法对3种肽段响应强度的影响(n=3)Fig. 4 Effect of different degreasing methods on the intensities of the three peptides (n=3)

酪蛋白的等电点为4.6,本研究分别考察盐酸、醋酸调节pH值,沉降离心后对澄清液酶解上机。结果表明,调节pH值会降低肽段的响应强度。可能是因为调节pH值会使牛乳铁蛋白内部疏水性氨基酸逐渐暴露聚集,降低了乳铁蛋白从乳清中的回收率[22],且质谱检测不受牛奶中大量酪蛋白负面影响。

图 5 人、牛、羊乳铁蛋白氨基酸序列图Fig. 5 Amino acid sequence of lactoferrin from human, bovine and goat sp|P02788|TRFL_HUMAN, sp|P24627|TRFL_BOVIN and sp|Q29477|TRFL_CAPHI represented human lactoferrin, bovine lactoferrin, and goat lactoferrin, respectively. The green, red and black represented the same, the similar, and the different amino acid sequence, respectively.

2.4 空白基质的选择

乳制品是复杂的食品基质,采用外标法定量法时,需考虑空白基质匹配以消除基质效应。牛、人和羊乳铁蛋白具有同源性,比对三者氨基酸序列(见图5),牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白序列同源性为70%,牛和羊乳铁蛋白序列同源性高达92%。绿字表示完全相同的氨基酸;红字表示为同一类氨基酸,结构和功能相似;黑字表示完全不同的氨基酸,3个特征肽段(红色背景标注)仅存在于牛铁蛋白,不存在人和羊乳铁蛋白中。考虑特异性和基质匹配效应[23],通过质谱确证表明羊奶粉中不含有特征肽段,其次羊奶粉成分配比和牛奶粉相近,可作为空白基质。

2.5 方法学验证

蛋白质组学定量方法根据是否对蛋白质进行标记可分为外标法(external standard method, ESM)和内标法(internal standard method, ISM)两类[24]。外标定量法不需要使用昂贵的稳定同位素标签,采用离子峰面积和离子浓度的相关性进行定量,成本低;内标定量法即引入稳定同位素标记(如13C、2H、18O、15N)的内标物质,使其具有相同色谱行为和离子化效率,提高精确性,然而制备同位素内标提高了成本[23]。本工作考察了外标法和内标法的线性关系、检出限、定量限、回收率、精密度等性能,并利用实际样品对两种检测方法的结果进行了对比。

2.5.1线性关系、检出限和定量限

建立2种标准曲线进行定量比较。

(1)外标法:吸取适量体积的乳铁蛋白储备液,以羊奶粉为空白基质,用水逐级稀释成系列浓度的标准工作溶液,酶解后用于质谱检测,以质量浓度为横坐标,特征肽段峰面积为纵坐标建立标准曲线。

(2)内标法:选择特征肽段SFQLFGSPPGQR考察内标法,设计内标肽段为SF(13C9、15N)QLFGSPPGQR。为降低质谱离子化效率及酶解效率的差异对检测结果的影响,在内标肽段两端分别加上与特征肽段相同的6个氨基酸GKNKSRSF(13C9、15N)QLFGSPPGQRDLLFKD作为内标物[16,25]。吸取适量体积的乳铁蛋白储备液,用水逐级稀释成系列浓度的标准工作溶液,每个浓度溶液中加入50 μL同位素内标,以质量浓度为横坐标,特征肽段和内标肽段峰面积比为纵坐标建立标准曲线。

两种方法的线性范围、回归方程、相关系数(R2)、检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)见表2。结果表明,采用外标法时3个肽段在各自范围内呈良好的线性关系,R2均大于0.99, 3个肽段的检出限为0.023～0.041 mg/kg,定量限为0.077～0.137 mg/kg。内标法结果与外标法基本相当。该结果优于大部分文献[16,17],能够满足牛乳铁蛋白在各类乳制品中的定量要求。

表 2 采用外标法和内标法时特征肽段的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L;Y′: peak area ratio of maker peptide to internal standard peptide.

2.5.2回收率和精密度

根据定量限及实际样品中牛乳铁蛋白的含量范围,选择0.1、1.0和10 mg/kg 3个水平的乳铁蛋白加入羊奶粉中,按照样品前处理步骤进行酶解后检测,考察方法的回收率。取空白基质,每个水平单独加标3次,按照1.2节方法酶解后,每个样品平行检测3次,考察日内精密度;连续3 d中,样品每个水平加标一次,酶解后,每个样品平行检测3次,考察日间精密度。如表3所示,外标法平均回收率为93.8%～103.9%,日内精密度≤8.8%,日间精密度≤9.5%;内标法平均回收率为98.5%～102.7%,日内精密度≤7.7%,日间精密度≤10.9%。

表 3 特征肽段的加标回收率、日内精密度和日间精密度

表 4 不同定量方法检测市售奶粉样品中牛乳铁蛋白的含量(n=3)

Detected contents: mean±SD.

2.6 实际样品检测

在实际样品检测时,首先考察了不同特征肽段对定量结果的影响,以及外标法与内标法之间的差异。分别采用外标法和内标法对3个市售奶粉样品进行定量检测,结果见表4。通过单因素方差分析比较外标法中3个特征肽段检测结果的差异性及外标法与内标法之间检测结果的差异性,得到P值分别为0.901 9和0.973 7,均>0.05,表明不同肽段之间及外标法与内标法之间均无显著性差异。为了降低检测成本,在后续的样品检测中采用SFQ外标法定量。

为验证所建方法的实用性,选取24份市售乳制品,包括婴幼儿配方奶粉、酸奶、巴氏乳、超高温瞬时灭菌乳(UHT),按照1.2节前处理步骤进行酶解,采用特征肽段SFQ进行定量,结果见表5。结果表明,奶粉中乳铁蛋白含量为223.13～4 299.07 mg/kg,部分婴幼儿配方奶粉会添加额外乳铁蛋白以增强免疫力;酸奶中含量为7.14～53.70 mg/kg,酸奶复杂的加工步骤会损失部分牛乳铁蛋白,可在发酵后添加乳铁蛋白以避免热变性和活性丧失,同时提高酸奶的营养价值[26];巴氏奶和UHT奶分别采用低温杀菌和超高温瞬时杀菌方法处理生牛乳,生牛乳中乳铁蛋白含量约为20～200 mg/kg,热处理和高压对牛乳铁蛋白造成一定损失[27],检测结果为59.45～116.16 mg/kg。

表 5 不同乳制品中牛乳铁蛋白的含量(n=3)

UHT: ultra high temperature instantaneous sterilization.

3 结论

本方法采用超高效液相色谱-串联质谱法检测乳及乳制品中的牛乳铁蛋白,共筛选出牛乳铁蛋白的8个特征肽段,选择其中3个特征肽段进行了定量分析,通过对比空白基质匹配的外标法和内标法对乳铁蛋白检测结果的差异,表明所建立的空白基质匹配定量方法与内标法无显著性差异,方法灵敏度高,重复性好,能够满足乳与乳制品中乳铁蛋白的定量检测需求。