QuEChERS-超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道离子阱质谱法检测鱼肉中15种降血脂药

王 佳,凌 云,邓亚美,张雨佳,杨旭升,刘利侠,刘晓敏,李东辉,张 峰*

(1. 锦州医科大学药学院, 辽宁 锦州 121001; 2. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100176)

降血脂药是一类能降低血浆甘油三酯或胆固醇的药物,其种类较多,主要有胆酸螯合剂、烟酸类、贝特类以及他汀类,其中贝特类和他汀类应用最多。他汀类主要是通过选择性抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(HMG-CoA)和降低甘油三酯(TG)水平以起到降低血脂的作用[1],但动物体内试验表明,降血脂药可以长时间存在于人体血浆中[2,3],且化学性质稳定[4],因此长期过量使用可能导致药物在人体内富集。降血脂药在降脂的同时,使用不当也可能会影响肝肾功能[5],可能引发横纹肌溶解症[6,7]等,甚至会有肾衰竭的风险[8]。

近年来,淡水短缺,再生水被认为是应对全球水资源短缺问题的一个较好的解决方案[9]。污水经过处理后形成的二次水可直接排入河流,也可作为农业灌溉的可行资源。据文献[10]报道,许多药物如降血脂药及其活性代谢物已被公认为新出现的环境污染物存在于废水中。因此,城市污水已被确定为将这些药物带入人们生活的主要物质之一。污水处理厂下游及沿线河流中的鱼类便成了药物进入生态系统的敏感体[11]。因此建立降血脂药的检测技术及分析方法尤为重要。

目前,国内有关食品中降血脂药的检测报道较少,主要为气相色谱-质谱法[12-17]、高效液相色谱法[18]、液相色谱-质谱法[19-25]。气相色谱-质谱法检测时前处理需要衍生化,步骤繁琐;高效液相色谱法能同时检测和分析的样品种类较少,化合物种类比较单一。本研究采用QuEChERS前处理技术,建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道离子阱质谱(UHPLC-Q/Orbitrap-MS)检测鱼肉中的15种降血脂药的方法,并检测了市售的各种鱼肉类。所建方法前处理步骤简单,重复性好,有助于鱼肉样品中降血脂药的筛查。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Q-Exactive-Ultimate 3000 RSLC超高效液相色谱-质谱仪(美国Thermo Fisher公司); Milli-R04超纯水发生器(德国Millipore公司); Allegra X-22R冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司); KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器公司); HSC-12B针式氮吹仪(天津恒奥科技有限公司)。

15种降血脂药标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司和美国Sigma公司),纯度最高为99%。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯,美国Thermo Fisher公司);乙酸铵、氯化钠、硫酸镁、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18(分析纯,美国Sigma公司)。

1.2 标准溶液的配制

准确称取15种标准品(10.0±0.1) mg,分别置于10 mL容量瓶中,加入10 mL甲醇,配制成质量浓度为1 g/L的标准储备液,于-20 ℃冰箱中储存待用。

分别移取15种降血脂药标准储备液100 μL,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容,混匀,配制得10 mg/L的降血脂药混合标准溶液,于4 ℃冰箱保存待用;用甲醇稀释,配制0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100和200 μg/L系列混合标准工作液,于4 ℃储存待用。

1.3 样品前处理

准确称取液体鱼肉5 g,置于50 mL离心管中,加入10 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液,涡旋1 min,分别加入2 g氯化钠和400 mg无水硫酸镁用于沉淀蛋白质和盐析,涡旋1 min,混匀,于-4 ℃以10 000 r/min离心10 min,提取上清液至第二个50 mL离心管中,加入100 mg PSA、160 mg C18和1.0 g乙酸钠,涡旋1 min,吸取上清液,置于10 mL试管中,于40 ℃水浴锅中氮吹至干,用1 mL甲醇溶解残留物,用0.22 μm尼龙滤膜过滤后,上机检测。

表 1 15种目标化合物的质谱参数

tR: retention time; * quantitative ion.

1.4 色谱条件

色谱柱:XBridge-C18液相色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm,美国Waters公司);柱温:35 ℃;流动相:A为乙腈,B为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含1.5 mmol/L乙酸铵);流速:0.2 mL/min。梯度洗脱程序:0～1 min, 30%A; 1～10 min, 30%A～65%A; 10～20 min, 65%A～98%A; 20～21 min, 98%A～30%A; 21～25 min, 30%A。进样体积:5 μL。

1.5 质谱条件

离子源:加热电喷雾电离(HESI)源,负离子与正离子模式同时监测;喷雾电压:3.6 kV;毛细管温度:350 ℃;鞘气流速:40 Arb;辅助气流速:10 Arb;全扫描(full-ms)分辨率:70 000;二级质谱扫描(dd-ms2)分辨率:35 000。15种降血脂药的质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

为使目标分析物达到最佳分离的效果,本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液,以及乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10和20 mmol/L的乙酸铵)作为流动相时的分离情况。当采用甲醇-水和乙腈-水体系时,乙腈-水体系对降血脂药的色谱分离效果优于甲醇-水体系,且响应更高。在乙腈-水体系中添加0.1%(v/v)甲酸(含1.5 mmol/L乙酸铵)时,色谱峰形最佳,因此选为所用。15种降血脂药(100 μg/L)的色谱图见图1。

2.2 样品前处理的优化

2.2.1提取溶剂的优化

实验分别以甲醇、乙腈、0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液、0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液(含1.5 mmol/L乙酸铵)为提取溶剂,采用基质匹配法比较各提取剂对目标化合物回收率的影响,考察不同提取溶剂的提取效果(见图2)。结果表明,采用0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液提取时,15种降血脂药的回收率最佳,且可有效缩短前处理的时间。因此选择0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液作为提取溶剂。

图 1 15种降血脂药(100 μg/L)的色谱图Fig. 1 Chromatograms of the 15 lipid regulators (100 μg/L)

2.2.2提取溶剂体积的优化

提取溶剂的体积是影响化合物提取效率的一个重要因素。本实验考察了采用5、10、15和20 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液提取时15种目标化合物的提取效率(见图3)。结果显示,采用10 mL和15 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液提取时提取效率相当,为了节省溶剂,最终选择10 mL。

图 2 不同提取溶剂对鱼肉中15种降血脂药回收率的影响(n=3)Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the 15 lipid regulators in fish meat (n=3)

图 3 提取溶剂体积对鱼肉中15种降血脂药回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effect of volumes of extraction solvent on the recoveries of the 15 lipid regulators in fish meat (n=3)

2.2.3QuEChERS净化条件的优化

鱼肉样品中存在脂肪、蛋白质、色素等杂质,QuEChERS吸附剂能否有效去除杂质且不对目标物有吸附作用。QuEChERS吸附剂有MgSO4、PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)、乙酸钠等。本文就鱼肉多脂肪、多蛋白质、多色素的性质选择了PSA、C18、乙酸钠3种吸附剂,并着重对吸附剂的用量进行了优化。本实验采用响应面法考察了不同吸附剂用量对鱼肉样品的净化效果,根据响应曲面法(RSM)的原理,使用Design-Expert软件中的中心复合设计(CCD)设计了具有3个因素和5个水平的20组实验,以考察3种吸附剂对目标物回收率的影响。3个因素分别为PSA、C18、乙酸钠,5个水平分别为20、60、100、140和180 mg (PSA)，40、100、160、220和280 mg (C18)，0.2、0.6、1.0、1.4和1.8 g(乙酸钠)。由图4可知,当PSA、C18和乙酸钠的用量分别为100 mg、160 mg和1.0 g时,目标化合物回收率相对较高,因此选为所用。

图 4 C18、PSA和乙酸钠的用量对回收率的影响Fig. 4 Effect of varying amount of C18, primary secondary amine (PSA) and sodium acetate on the recoveries

2.3 基质效应

应用液相色谱-质谱法检测复杂基质样品时,基质共提物会对目标物的离子化具有基质增强或基质抑制效应,从而影响对目标物的定量测定。根据公式基质效应(ME)=(1-Ss/Sm)×100%计算基质效应值,其中,Ss和Sm分别是基质匹配校准曲线和纯溶剂校准曲线的斜率[26]。当ME=-20%～20%时为弱基质效应;当ME=-50%～-20%或20%～50%时为中等基质效应;当ME<-50%或>50%时为强基质效应。本实验考察了5种鱼肉基质中目标化合物的基质效应,结果表明,15种降血脂药具有弱基质效应或中等基质效应,因此采用基质匹配标准曲线法用于降血脂药的定量分析。

2.4 方法学考察

2.4.1线性关系、检出限和定量限

按1.2节配制15种降血脂药的混合标准工作液,分别添加到5 g空白鱼肉中,按1.3节和1.4节方法处理并检测,以峰面积(Y)为纵坐标、对应的质量浓度(X, μg/L)为横坐标绘制标准曲线(见表2)。结果表明,15种降血脂药在各自范围内线性良好,相关系数(R2)均大于0.99。

在空白样品中分别添加系列浓度的目标化合物混合标准溶液,以3倍和10倍信噪比确定检出限(LOD)和定量限(LOQ)。实验结果表明,15种降血脂药的检出限为0.2～1.0 μg/kg,定量限为0.3～3.1 μg/kg(见表2)。

2.4.2回收率与精密度

取18份空白鱼肉样品,分成3组,分别添加LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ 3个水平的15种目标化合物混合标准溶液,每份样品测定一次,间隔3 d后再一次测定。结果表明,15种目标化合物的平均回收率为76.4%～116.0%,日内精密度为1.0%～7.9%,日间精密度为1.7%～18.4%(见表3),准确度和精密度满足残留检测要求。表明该方法可靠准确,适合15种降血脂药的检测分析。

表 2 15种降血脂药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 15种降血脂药的平均回收率和相对标准偏差(n=6)

2.5 实际样品的测定

利用上述方法对从北京某市场购买的20份鱼肉样品进行测定。在2个样品中观察到痕量的非诺贝特和环丙贝特,其含量

图 5 标准溶液和实际样品中非诺贝特和环丙贝特的色谱图和质谱图Fig. 5 Chromatograms and mass spectra of the fenofibrate and ciprofibrate in the standard solutions and real samples a. fenofibrate in the standard solution; b. fenofibrate in the real sample; c. ciprofibrate in the standard solution; d. ciprofibrate in the real sample.

3 结论

本研究建立了QuEChERS-超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道离子阱质谱法,实现了鱼肉中15种降血脂药的定性和定量分析。该法操作简单,重复性好,分辨率高,能同时对鱼肉中15种降血脂药残留进行筛查定量。