加速溶剂萃取-气相色谱-串联质谱法同时测定贝类中64种农药残留

张云青,孟祥龙,范广宇,马桂珍,唐 秀,李配婷

(1. 江苏海洋大学, 江苏 连云港 222051; 2. 连云港海关, 江苏 连云港 222042)

近年来,随着生活水平的不断提高,人们对日常食品营养价值的认识不断深入,水产品因富含优质蛋白质,在人们的饮食结构中占据着重要地位。但是在渔业生产实践中,常采用三唑磷、氯氰菊酯、溴氰菊酯等杀虫剂作为清塘剂来杀死杂鱼,保护贝类种苗,清除有害生物等[1,2],这些农药对水产品毒性较大,常引起渔业污染事故,具有潜在的农药残留生态风险[3]。本课题组[4]在前期研究中发现贝类产品中有毒死蜱、扑草净、西玛津等农药残留,另外,国内外也有研究[5-7]发现敌敌畏、氰戊菊酯、滴滴涕等有机氯类、拟除虫菊酯类农药残留于水体环境中,这些农药可能通过食物链富集到人体内,危害人类健康。因此,建立一种快速、准确地筛查水产品多种农药残留的方法具有重要意义。

农药残留的分析方法主要有气相色谱法[8]、气相色谱-串联质谱法[9]和液相色谱-串联质谱法[2]。气相色谱-串联质谱法在同时定性定量方面比气相色谱有明显优势。水产品中含有大量的蛋白质、脂肪、类固醇类等化合物,易造成仪器污染,干扰目标农药的检测[10]。因此,建立良好的前处理方法是关键。常见的水产品萃取方法有固相萃取法[11]、QuEChERS法[1]、凝胶渗透色谱法[12]等,而加速溶剂同步萃取净化法不仅具有加速溶剂萃取法萃取效率高、重复性好、自动化程度高等优点[12-17],同时能省去净化步骤,缩短前处理时间。目前该方法主要用于土壤及沉积物基质中多氯联苯、多氯烃类以及水产品中的有机磷阻燃剂类的检测[18-20],但未发现将加速溶剂同步萃取净化法用于水产品中多农药残留检测的报道。因此,本文建立了加速溶剂同步萃取净化-气相色谱-串联质谱同时测定贝类中多种农药残留快速筛选、确证及定量的系统分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ 8000气相色谱-串联质谱仪(配有三重四极杆检测器和Trance Finder 3.1数据处理系统)、ASE350加速溶剂萃取仪(配有22 mL不锈钢萃取池)(美国Thermo Fisher Scientific公司); N-EVAP TM型氮气吹干仪(美国Organomation Associates公司)。

64种农药标准品(见表1):扑草净、西草净、戊草净、锐劲特、恶草酮、禾草灵、腈菌唑固体农药标准品(纯度均大于97%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司,其余57种农药标准品(100 μg/mL)购自农业部环境保护科研监测所。乙腈、丙酮均为色谱纯(德国Merck公司);N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化炭黑(GCB)(美国Agilent公司);实验用水均为超纯水;氯化钠为优级纯(中国国药试剂公司);样品采自附近水产养殖基地。

1.2 标准溶液的配制

准确称取固体标准品,置于棕色容量瓶中,用丙酮准确定容,配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液,置于-18 ℃冰箱中保存,备用。分别吸取上述标准储备液,逐级稀释后得质量浓度均为1 mg/L的64种农药混合标准储备液,置于-18 ℃冰箱中保存,备用。使用前将64种农药的混合标准储备液恢复至室温,并用乙腈稀释至所需浓度,现用现配。

1.3 样品前处理

称取制备好的空白文蛤基质5.0 g,置于研钵中,加适量硅藻土,研磨均匀后,转入22 mL萃取池中(底部已添加0.8 g PSA和0.8 g GCB)。萃取溶剂为90%(v/v)乙腈水溶液,萃取温度85 ℃,冲洗体积60%萃取池体积,循环1次。加速溶剂萃取后,萃取液中加入5.0 g氯化钠粉末,进行摇匀振荡,离心,取上清液旋转蒸发至近干,用乙腈定容至1.0 mL,以3 500 r/min离心5 min,过0.22 μm滤膜,待GC-MS/MS测定。

1.4 仪器条件

色谱柱:HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度:250 ℃;进样模式:不分流进样;载气:高纯氦气;流速:1.0 mL/min;升温程序:初始温度50 ℃,保持1 min,以20 ℃/min的速率升至150 ℃,以3 ℃/min的速率升至230 ℃,再以10 ℃/min的速率升至290 ℃,保持3 min;进样量:1 μL。

离子源:EI源;离子源温度:250 ℃;传输线温度:290 ℃;发射电流:50 μA;分析模式:MRM模式;碰撞气(Ar)压力:0.159 6 Pa。64种农药的其他质谱参数见表1。

表 1 64种农药的保留时间、监测离子对和碰撞能量(CE)

表 1 (续)

* Parent ion.

图 1 不同体积分数的乙腈水溶液对64种农药萃取效率的影响Fig. 1 Effects of the different volumes of acetonitrile aqueous solution on the recoveries of the 64 pesticides

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的优化

据相关研究[21]发现,由于水产品富含蛋白质基质,使用乙腈水溶液温和提取农药,效率更高。因此实验分别研究了纯乙腈,以及体积分数为60%、70%、80%、90%乙腈的水溶液作为提取溶剂时的提取效率(见图1)。结果表明,随着乙腈体积分数的不同,目标分析物的回收率受到明显影响。使用纯乙腈时,回收率在70%～120%之间的目标分析物仅有47个,数量最少,并且在此梯度提取条件下,有12个目标分析物回收率低于70%,主要为有机磷类化合物。可能是使用纯乙腈时,蛋白质变性速率过快,聚集沉淀,包裹这些药物,导致化合物回收率偏低。在使用90%乙腈水溶液作为提取溶剂时,目标分析物回收率在70%～120%之间的数量最多,仅有氟氰戊菊酯、氯菊酯、甲基对硫磷的回收率高于120%。提取溶剂为70%乙腈水溶液时,回收率小于70%的8个目标分析物主要也是以上几种有机磷化合物,说明有机磷化合物受亲水作用影响较明显,可能蛋白质在有机溶剂水溶液中的变性程度相较于纯有机溶剂更加完全[22]。当乙腈的体积分数低于70%时,蛋白质不能完全变性,无法与这些药物分离完全。因此,综合考虑,本实验选择90%乙腈水溶液作为最佳提取溶剂。

2.2 加速溶剂萃取其他参数的优化

实验除了考察萃取溶剂外,还考察了其他影响加速溶剂萃取效率的因素,包括萃取温度(65、85和105 ℃)、循环次数(1、2和3次)和冲洗体积参数(60%、80%和100%)(见图2)。结果发现,随着萃取温度的升高，目标分析物的回收率也逐渐增加,但基本上在70%～120%之间,但当萃取温度为105 ℃时,敌敌畏、甲胺磷的回收率降低,低于70%,可能由于温度的升高,这两种化合物对热不稳定而分解,且随着温度的升高,共萃取物含量更多,不利于后续净化过程。综合考虑选取85 ℃为萃取最适温度。

如图2所示,发现冲洗体积为60%萃取池体积时,目标农药的回收率基本在70%～80%之间;而40%时回收率低于70%的农药偏多,可能由于冲洗体积较少,提取溶剂未能充分接触基质样品,部分农药提取不充分,导致回收率偏低;当为80%时,部分农药回收率大于110%,可能随着冲洗体增加,共萃取物增多,导致基质效应的增强。综合考虑选取冲洗体积为60%萃取池体积。

图 2 萃取温度、萃取池冲洗体积分数、循环次数对64种目标农药回收率影响Fig. 2 Effect of extraction temperatures, flush volume fractions of the pool volume and numbers of cycles on the recoveries of the 64 target pesticides

实验发现,萃取过程中循环次数的不同，农药的回收率基本均高于80%,但随着次数的增加,回收率高于110%的农药也增多,可能随着次数增加,共萃取物增多,基质效应增强,同时,考虑到溶剂对环境的污染,最终选取循环次数为1次。

2.3 净化材料的优化

未添加净化材料时,提取液经GC-MS/MS测定后,通过观察全扫描色谱图,并结合NIST谱库定性,较大的干扰峰主要分布于8～22 min(脂肪酸色谱峰)和34～40 min(胆固醇色谱峰)之间。因此需要对样品进行净化,采用较多的净化材料为PSA和GCB[1,23]。本实验考察了PSA(0.2、0.4、0.6、0.8、1.2和1.4 g)和GCB(0.4、0.6、0.8和1.2 g)的用量对净化效果的影响。

未添GCB时,考察了PSA用量(0.2、0.4、0.6、0.8、1.2和1.4 g)对净化效果和萃取效率的影响。如图3a所示,当PSA添加量为0.8 g时,脂肪酸的峰面积明显减小,回收率基本在70%～120%之间,但当添加量达到1.2 g时,脂肪酸干扰峰基本被消除,但是大多数有机磷类目标分析物回收率低于70%。因此,PSA最适添加量选为0.8 g。

PSA添加量为0.8 g时,考察了GCB不同添加量(0.4、0.6、0.8和1.2 g)的净化效果和萃取效率。如图3b所示,当GCB添加量达到0.8 g时,胆固醇干扰峰明显减小,提取液颜色也呈无色透明状态,同时目标分析物回收率也在70%～120%之间;当添加量为1.2 g时,六氯苯、敌敌畏、甲胺磷等目标分析物的回收低于50%。综合考虑,GCB添加量为0.8 g。

图 3 (a)PSA和(b)GCB不同添加量下提取液的全扫描色谱图Fig. 3 Full scan chromatograms of extracts at different amounts of PSA and GCB PSA: primary secondary amine; GCB: graphitized carbon black.

2.4 方法学验证

分析方法的验证根据标准GB/T 27417-2017要求进行评估,方法确认参数包括方法检出限(MDL)、定量限、线性关系、准确度、精密度和基质效应(ME)。

2.4.1线性关系和MDL

配制质量浓度为10.0、20.0、50.0、100.0、400.0和1 000.0 μg/L的64种农药混合标准溶液,以峰面积(y)对质量浓度(x, μg/L)进行线性回归,绘制标准工作曲线,得到的线性回归方程和决定系数(r2)见表2。

根据《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168-2010)方法及其计算公式MDL=S×t(n-1, 1-α=0.99)计算方法检出限。其中,n=重复测定的加标样品数,S=n次加标测定浓度的标准偏差,t=自由度为n-1时的Student’st值(可查表得到); 1-α为置信水平。以3～5倍MDL值对应的浓度定义方法的定量限(见表2)。

在线性范围10.0～1 000 μg/L内,64种农药的决定系数在0.989以上,线性良好;方法检出限为0.7～3.3 μg/kg,定量限为2.0～10.0 μg/kg,显示具有较高的灵敏度。

表 2 64种农药的决定系数、方法检出限、定量限、基质效应、回收率和精密度(n=6)

表 2 (续)

-: pesticides were not spiked at this level.

2.4.2基质效应

为了考察基质效应的影响,对文蛤空白样品按照1.3节方法处理,得到空白基质液,按照10.0、20.0、50.0、100.0、400.0和1 000.0 μg/L浓度梯度配制基质匹配标准溶液,同时用乙腈试剂配制相同系列浓度的标准溶液,分别绘制标准曲线。按照公式进行计算:ME=[(基质匹配校准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率)-1]×100%。|ME|<20%为弱基质效应,20%≤|ME|≤50%为中等基质效应,|ME|>50%为强基质效应。

根据表2可知,46.9%的化合物表现出基质抑制效应(ME<0),而51.6%的化合物表现出基质增强效应(ME>0)。47%的化合物的基质效应(-20%

2.4.3回收率和精密度

采用空白文蛤样品,按照1.3节前处理方法处理后,分别对64种农药进行2.0、5.0、10.0和100.0 μg/kg 4个水平的添加回收试验,每个水平重复测定6次,得到方法的回收率和精密度见表2。结果表明,64种农药的平均回收率为69.4%～129.7%,精密度为0.7%～16.0%(n=6),均满足基本要求。

综合以上结果,所开发的方法灵敏度高,稳定性强,重复性好,能满足标准GB/T 27417-2017评估参数要求,适用于贝类水产品中农药残留的检测。

2.5 实际样品的检测

除了进行方法验证外,还将该方法应用于33批次贝类样品(文蛤8批次、扇贝11批次和河蚬14批次)检测,仅检出2种高于定量限的农药。滴滴涕最高残留量为30.3 μg/kg,毒死蜱最高残留量为18.9 μg/kg,其余农药均为低于定量限或未检出。最新的国家标准《食品中农药最大残留限量》[24]中针对水产品做出限量要求的只有六六六和滴滴涕,分别为0.1 mg/kg和0.5 mg/kg,其余农药残留没有制定限量要求,国际食品法典委员会(CAC)、欧盟和美国等组织、国家和地区也没有相关的限量要求,但根据日本一律标准0.01 mg/kg的限量要求[25],贝类产品中农药残留风险较高,因而需要进一步研究来评估潜在的风险。

3 结论

本研究通过对加速溶剂萃取溶剂、萃取温度、循环次数,以及净化材料的优化,建立了加速溶剂同步萃取净化-气相色谱-串联质谱同时测定贝类中64种农药残留的方法。实际检测结果表明,该方法样品提取和净化同步完成,减少了净化步骤,提取效率高,自动化程度高,重复性好,灵敏度高,能够为贝类水产品中多种农药残留的痕量监测提供技术支撑。