衍生化-气相色谱-三重四极杆质谱法同时测定粮食作物中三氯甲基吡啶及其代谢物残留

孙灵慧,陈 捷,徐 娟,李敏青,陈文锐

(广州海关技术中心, 广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室, 广东 广州 510623)

当前,粮食作物种植存在过量施用氮肥的现象[1,2],这降低了氮肥利用率,氮素损失严重[3],引起一系列的环境污染问题。三氯甲基吡啶(nitrapyrin),即2-氯-6-三氯甲基吡啶的简称,是一种土壤氮肥保护剂,和氮肥配合使用于田间,可以有效地抑制硝化细菌对氨态氮的硝化作用[4],能减少氮肥损失,延长肥效期,提高化肥的利用率[5]。其原理是延长氮素在土壤中以铵态氮形态存在的时间,由此可以减少氮肥以硝态氮的形式淋溶损失以及反硝化作用[6],此外,三氯甲基吡啶也是重要的农药医药中间体。近年来国内外对三氯甲基吡啶的研究主要是关于其对土壤的硝化抑制作用及对谷物的增产效果和制备工艺的研究[7-9],对测定其在蔬菜、水果、粮谷等食品中残留方法的研究资料还相对较少,常见报道都为氨氯吡啶酸的测定[10,11],且采用气相色谱-三重四极杆质谱技术在玉米及其他粮谷农残方面的应用在国内外尚未见报道[12],主要参考气相色谱-三重四极杆质谱法测定蔬菜、水果、粮谷等中其他农药残留方法的标准和文献[13]。现仅美国、日本和韩国规定了最大残留限量,分别规定了粮食作物及其副产品中三氯甲基吡啶的最大残留限量范围为0.1～6 mg/kg;欧盟、加拿大均无相关限量要求。我国香港地区《食物内除害剂残余规例》[14]规定了三氯甲基吡啶的残留量,其中,爆谷、高粱及玉米中三氯甲基吡啶及其代谢物6-氯吡啶甲酸之和的建议限量为0.1 mg/kg,小麦的建议限量为0.5 mg/kg。目前,我国GB 2763-2019尚未制定其最大残留限量。因此,建立三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的有效检测方法,可为粮食作物中的代谢研究提供可行的技术支撑,为制定国内粮食作物中三氯甲基吡啶的最大残留限量提供基础数据,对有效控制氮肥施用量、促进农业的健康发展、保障广大人民群众的食用安全具有深远的意义。

仇珍等[15]测定了稻米中三氯甲基吡啶代谢物6-氯吡啶甲酸的残留量,样品经乙醚提取净化,导入重氮甲烷甲酯化后定容,使用带电子捕获检测器的气相色谱仪进行分析。该方法仅检测了代谢物的残留量,并且导入的重氮甲烷受热、遇火、摩擦、撞击会导致爆炸,危险性高,不适合常规检测。本工作在前人研究的基础上,参考QuEChERS方法[16],选择了相对安全的衍生试剂浓硫酸,对样品前处理过程进行了优化,结合气相色谱-三重四极杆质谱法(GC-MS/MS),建立起高粱、小麦、玉米及爆谷等粮食作物中三氯甲基吡啶残留量的分析方法。该方法操作简便,前处理成本低,灵敏度高,抗干扰能力强,定性定量准确,弥补了国内粮食作物中三氯甲基吡啶及其代谢产物检测方法的空白。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ FortisTM型气相色谱-三重四极杆质谱联用仪,配有电子轰击源(EI+)(赛默飞世尔科技(中国)有限公司); 3-18KS离心机(美国Sigma公司); Biotage全自动氮吹浓缩仪(LV型,美国Biotage公司);赛多利斯BSA124S-CW电子分析天平(赛多利斯科学科学仪器(北京)有限公司);恒温振荡水浴箱(北京五洲东方科技发展公司); MS3 basic涡旋混合器(德国IKA公司); Heidolph Multi Reax多位试管涡旋振荡器、Heidolph往复式振荡器、Promax摇床(德国Heidolph公司)。

三氯甲基吡啶(纯度99.4%)、6-氯吡啶甲酸(纯度99.0%)及2-吡啶甲酸甲酯(纯度98.0%)标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司);无水硫酸镁、氯化钠(分析纯,广州化学试剂厂);海砂(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);乙酸乙酯、乙腈、甲醇(HPLC级,美国Fisher公司);去离子水由Millipore公司超纯水机制得;15 mL QuEChERS净化管,含200 mg MgSO4、50 mgN-丙基乙二胺(PSA)、100 mg石墨化炭黑(100～200目)、100 mg C18,均购自博纳艾杰尔科技公司。

1.2 样品前处理

取市售具有代表性的粮食作物高粱、小麦、玉米及爆谷各2 kg,用粉碎机粉碎后密封,于阴凉处避光保存。

称取5 g样品(精确至0.01 g)至50 mL离心管中,加入15 g海砂搅拌均匀,加入5 mL水涡旋振荡均匀,静置10 min。加入10 mL乙腈、0.1 mL甲酸,振摇15 min,加3 g氯化钠,振摇5 min,于4 000 r/min离心5 min。取4 mL上清液至已配好的15 mL净化管中涡旋振荡3 min,取2 mL净化液待用。将净化液吹至近干,立即加入1 mL甲醇复溶,在冰水浴中加入200 μL浓硫酸,振匀。于55 ℃水浴摇床中衍生30 min后,于50 ℃氮吹浓缩,用1 mL乙酸乙酯复溶。将复溶液转移至50 mL离心管,加入5 mL饱和氯化钠溶液,振荡提取后移取上清液,再向15 mL离心管中分两次加入共6 mL乙酸乙酯,振荡并提取上清液。合并上清液于50 mL离心管中,再加入2 mL 2%(质量分数)的硫酸钠水溶液,洗涤,移取乙酸乙酯层于吹氮管中,氮吹浓缩至近干,用2 mL正己烷复溶,加入内标物质2-吡啶甲酸甲酯,振匀后经0.2 μm滤膜过滤后,供GC-MS/MS测定。

1.3 色谱条件

色谱柱:THERMOTR-35MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);色谱柱温度:70 ℃保持1.5 min,以20 ℃/min升温至180 ℃,然后以5 ℃/min升温至210 ℃,再以25 ℃/min升温至280 ℃,保持5 min;载气:氦气,纯度≥99.999%,流速1.2 mL/min;进样口温度:250 ℃;进样量:1 μL;进样方式:不分流进样。

1.4 质谱条件

电子轰击源:70 eV;离子源温度:230 ℃;传输线温度:280 ℃;溶剂延迟:3 min;扫描方式:多选择反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM);待测物的其他参数见表1,用Mass Hunter工作站进行仪器控制和数据处理。

表 1 三氯甲基吡啶及其代谢产物的MRM参数

* 6-Chloro-2-picolinic acid methyl ester is a derivative of the metabolite of nitrapyrin.

图 1 净化条件对三氯甲基吡啶及其代谢物回收率的影响Fig. 1 Effects of purification conditions on the recoveries of nitrapyrin and its metabolite

图 2 衍生时间对衍生物回收率的影响Fig. 2 Effect of the derivatization time on the recovery of the derivative

2 结果与分析

2.1 净化条件的优化

由于粮食作物中含有大量的油脂、糖分等干扰物,容易形成基质干扰,因此必须对其进行净化处理,以达到减少基质效应的效果。以高粱、小麦、玉米及爆谷为样品基质,采用QuEChERS方法,添加PSA、石墨炭黑、C18的净化粉进行净化。净化过程中,加标0.2 mg/kg,分别对3种净化粉的用量进行优化(见图1)。最终选用净化粉的用量为:MgSO4200 mg、C18 100 mg、PSA 50 mg和GCB 100 mg。

2.2 衍生条件的优化

分别考察了衍生时间和衍生物加入量对三氯甲基吡啶及其代谢产物定量测定时的回收率的影响。以玉米基质为例,衍生时间分别选取了10、20、30、60 min。对6-氯吡啶甲酸进行考察,衍生30 min时,回收率达到最高值,随后略有下降(见图2)。测定结果显示,衍生10 min响应最低,20 min后略有升高,之后趋于稳定。故选择衍生时间30 min。

图 3 硫酸用量对衍生物响应值的影响Fig. 3 Effect of the sulfuric acid amount on the response of the derivative

考察衍生物浓硫酸的添加量,对比同等浓度的6-氯吡啶甲酸标准溶液中添加50、100、200、300 μL浓硫酸后的影响(见图3)。结果发现,加100 μL浓硫酸即可以衍生完全,转化率稳定。转化率为衍生后标准物质响应浓度与标准物质理论浓度的比值。在此试验基础上发现,在样品基质中添加相同浓度的标准品时,若仅加100 μL浓硫酸,会因杂质消耗硫酸,导致衍生转化率下降,而加入200 μL的浓硫酸后结果相对稳定。因此,最终对样品进行衍生时,选择了添加200 μL浓硫酸。

2.3 色谱柱的选择

分别考察了色谱柱DB-1701、DB-INOVWAX、DB-5MS和TR-35MS对三氯甲基吡啶及其代谢产物进行色谱分离时的峰形和灵敏度。如图4所示,DB1701柱和DB-INOVWAX柱仅能分离三氯甲基吡啶,但无法有效分离代谢物;比较另外两种色谱柱,TR-35MS柱涂渍层为(35%苯基)-聚硅氧烷固定液,可使三氯甲基吡啶和6-氯-2-吡啶羧酸甲酯的峰形尖锐、无拖尾,灵敏度更高,同时色谱柱价格适中,因此选为实验所用。

图 4 采用不同色谱柱分离三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯的色谱图Fig. 4 Chromatograms of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester separated on different columns

2.4 质谱条件的优化

利用EI源,在正离子模式下,分别对三氯甲基吡啶和6-氯-2-吡啶羧酸甲酯进行一级质谱分析(Q1扫描),得到母离子峰,对母离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描),得到碎片离子信息,由此确定定量、定性离子对。

本方法采用Timed选择离子模式,由于对离子扫描只在其相应保留时间的一个狭窄区域内进行,因此,相对于常规的选择离子模式,在整个相同的扫描过程中,可以使更多对离子获得更长的驻留时间,从而提高灵敏度,且尽可能减少峰与峰之间的相互干扰。

采用MRM模式采集数据,通过优化碰撞能量,使各离子对达到最好响应,MRM参数见表2。

三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯(内标)的标准品全扫描质谱图及多反应监测色谱图见图5和图6。

图 5 三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯标准品的全扫描质谱图Fig. 5 Full scan mass spectra of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester standards

图 6 三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯标准品的MRM色谱图Fig. 6 MRM chromatograms of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester standards

2.5 基质效应

按如下计算方法对基质效应(ME)进行评价:ME=(空白基质匹配标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率-1)×100%。当ME为负值时表示存在基质抑制效应,正值时表示存在基质增强效应;绝对值越大则基质效应越强,如恰好为0,则表示不存在基质效应[17]。结果表明,三氯甲基吡啶在各基质溶液中受到一定的基质增强作用,爆谷和玉米样品的基质效应最为明显,为+13.6%;而其代谢物的衍生物6-氯-2-吡啶羧酸甲酯在各基质溶液中受到一定的基质抑制作用,尤其是爆谷样品基质抑制效应最为明显,为-57.1%,玉米样品的基质效应略低,为-48.2%。总的来说,小麦和高粱的基质效应相对较小。对于粮谷类基质而言,经本方法净化处理后,目标化合物的基质效应均在可接受范围内。采用基质匹配内标法测定实际样品,也可在一定程度上对基质效应的影响进行补偿。

2.6 线性范围、线性方程和检出限

用空白基质溶液(不含三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的高粱、小麦、玉米及爆谷样品)分别配制质量浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的系列三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的基质匹配溶液,对其进行分析,分别以三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸标准工作溶液质量浓度为横坐标(X),以三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸定量离子峰面积除以内标峰面积的值与内标质量浓度的乘积为纵坐标(Y),绘制标准工作曲线,所得线性方程及相关系数(r2)见表3。当样品中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的质量浓度超出0.025～0.4 mg/L这一线性范围时,适当加大样品的稀释倍数。

在本方法测定条件下,以信噪比(S/N)>3时基质标准溶液的浓度乘以方法的稀释倍数推算出方法检出限(LOD)。选择空白玉米样品,当添加水平为0.05 mg/kg时,S/N>10,表明其定量限(LOQ)可达到0.05 mg/kg。该定量限满足我国香港地区《食物内除害剂残余规例》[14]中的最高残留限量要求。检出限及定量限结果见表2。

2.7 回收率和精密度

在不同空白样品基质中添加3个水平(0.05、0.1、0.2 mg/kg)的标准品进行加标回收试验,每个添加水平重复6次,结果见表3。结果表明,三氯甲基吡啶及6-氯吡啶甲酸的回收率为80.4%～98.4%,相对标准偏差为1.0%～10.1%(n=6),方法的精密度和准确度能够满足定量分析的要求。

2.8 实际样品的检测

随机购买市售的高粱样品15个、小麦样品10个、玉米12个及爆谷15个,按照本研究建立的检测方法进行测定,52种粮食作物均未检出三氯甲基吡啶及其代谢产物。

表 2 不同基质中三氯甲基吡啶及其代谢物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Y: peak area of product ion/peak area of internal standard×mass concentration of internal standard;X: mass concentration, g/L. Linear range: 0.025-0.4 mg/L.

表 3 不同基质中三氯甲基吡啶及其代谢物的加标回收率和精密度(n=6)

3 结论

本研究采用酸性乙腈提取,QuEChERS方法净化,浓硫酸衍生后提取衍生物,建立了同时测定粮食作物中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸残留的气相色谱-三重四极杆质谱检测方法,回收率、精密度和检出限均满足粮食作物中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸残留限量的要求。