分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健品片剂中5种黄芩素类化合物

岑建斌,梁志森,区硕俊,黄嘉乐,李秀英,林青兰,陈玉珍,刘炘杰,林森煜

(广州检验检测认证集团有限公司, 国家加工食品质量监督检验中心, 广东 广州 511447)

随着社会经济的发展,人们生活得到改善,越发关注自身健康,因此保健品的需求不断扩大。各类添加植物提取物的保健品备受消费者青睐。特别是黄芩被大量使用到保健品片剂中。野黄芩素(scutellarein)、4′-羟基汉黄芩素(4′-hydroxywogonin)、去甲汉黄芩素(norwogonin)、黄芩素(baicalein)和汉黄芩素(wogonin)是黄芩等植物提取物的主要活性成分,它们具有护肝[1]、抗氧化[2]、抗糖尿病[3]、抗炎、保护神经[4]、抗纤维化[5]、抗病毒[6]、抗癌[7]等作用。

除了黄芩植物外,5种黄芩素还存在于多种植物中,不同草药对成品有带入作用。加之不同企业有不同的添加标准,同时因为混合技术、加工过程、质量控制等因素影响,易造成黄芩素损失或过量添加,黄芩素类物质含量在不同产品间差别很大。由于过量摄入相关成分对人体的危害尚未明确,这些产品可能会为人们带来潜在健康风险,因而对黄芩素含量的测定对保健品价值的评价具有重要意义。目前,针对黄芩素类物质的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[8-11]、毛细管区带电泳(CZE)-电化学检测法[12,13]、大气压采样高分辨质谱法[14]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[15-17]、HPLC-高分辨飞行时间质谱法[18],这些分析方法的研究目前主要集中在草药及血清成分分析方面,针对保健品片剂的定性定量研究鲜有报道。其中,HPLC及CZE-电化学检测法灵敏度较低,对样品富集要求较高。大气压采样高分辨质谱法及HPLC-高分辨飞行时间质谱法虽然灵敏度高,但定量效果较三重四极杆质谱差,而且仪器价格高昂,方法较难普及。HPLC-MS/MS则具有灵敏度高,定量准确的优点,对于容易受样品基质干扰的化合物,具有更好的分析能力。在前处理方面,主要有固相萃取法[16,19]和分散液液萃取法[18,20]等。固相萃取法操作复杂,操作时间较长,分散液液萃取法需要使用大量有机溶剂萃取且无有效的净化措施,当目标物存在干扰时无有效解决措施。分散固相萃取技术结合液液萃取和固相萃取的原理,利用吸附剂吸附杂质,溶剂用量少,具备环保,灵敏度高,高效快速等优点[21,22],适用于保健品片剂中5种黄芩素的提取净化。本文采用分散固相萃取技术结合HPLC-MS/MS技术对保健品片剂中的5种黄芩素(结构见图1)进行测定,所建立的分析方法操作简便快速,回收率高,重现性好,适用于实验室的日常分析测定。

CompoundR1R2R3ScutellareinHOHOH4′-HydroxywogoninOCH3HOHNorwogoninOHHHBaicaleinHOHHWogoninOCH3HH图 1 5种黄芩素的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of the five baicaleins

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Scientific U3000超高效液相色谱仪, Thermo Scientific TSQ Endura三重四极杆质谱仪(配有电喷雾(H-ESI)离子源)(美国Thermo Scientific公司);Genius NM32LA氮气发生器(英国Peak Scientific Instruments公司); 3K15高速冷冻离心机(德国Sigma公司); KDC-40低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司); Multi Reax混匀振荡器(德国Heidolph公司); ML204T电子天平(瑞士Mettler Toledo公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

野黄芩素(CAS No. 529-53-3,纯度98.5%,上海诗丹德标准技术服务有限公司); 4′-羟基汉黄芩素(CAS No. 57096-02-3,纯度≥98%)、去甲汉黄芩素(CAS No. 4443-09-8,纯度≥98%)、汉黄芩素(CAS No. 632-85-9,纯度≥98%),均购自武汉天植生物技术有限公司;黄芩素(CAS No. 491-67-8,纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司)。

乙腈、丙酮、乙酸乙酯均为HPLC级(德国Merck公司);甲酸为分析纯级(美国Sigma Aldrich公司);二甲亚砜、氯化钠均为分析纯级(广州化学试剂厂); C18净化填料和石墨化炭黑(GCB)购自上海安谱实验室科技股份有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)购自美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1样品前处理

取保健品片剂20 g,粉碎,混合均匀,称取1.0 g(精确至0.001 g)样品于50 mL离心管中,准确加入5 mL水和10 mL丙酮,涡旋振荡提取10 min,加入5 g氯化钠,涡旋混合均匀30 s, 4 000 r/min离心2 min,取1 mL上清液转移至装有75 mg C18吸附剂的高速离心管中,涡旋1 min, 10 000 r/min高速离心2 min,上清液过0.22 μm尼龙膜,待测。

1.2.2标准溶液的配制

分别准确称取适量标准物质,用甲醇溶解黄芩素、汉黄芩素,用二甲亚砜溶解野黄芩素、4′-羟基汉黄芩素、去甲汉黄芩素,分别配制成1 000 mg/L标准储备液,于-20 ℃保存。分别取100 μL和10 μL储备液至同一容量瓶中,用丙酮定容至10 mL,配制得到10 mg/L和1 mg/L的混合标准工作液。

使用压片糖果空白基质溶液配制基质混合标准溶液。

1.2.3液相色谱条件

色谱柱:Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm,美国Thermo Scientific公司);流动相:A为0.1%(v/v)甲酸乙腈;B为0.1%(v/v)甲酸水。梯度洗脱:0～4.0 min, 90%B; 4.0～15.0 min, 90%B～45%B; 15.0～15.5 min, 45%B～90%B; 15.5～18 min, 90%B。流速:0.3 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:5 μL。

1.2.4质谱条件

电喷雾离子源(H-ESI);正离子模式;离子源电压:3 500 V;碰撞气:高纯氩气(纯度>99.999%);鞘气: 4.58 L/min;辅助气: 8.85 L/min;吹扫气: 0 L/min;离子传输管温度: 330 ℃;蒸发温度: 330 ℃;选择离子反应扫描模式(selective reaction monitoring, SRM);质谱采集参数见表1。测量数据采用赛默飞TraceFinder Software 3.0(美国Thermo Scientific公司)进行采集和处理。

表 1 5种目标物的质谱参数

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 色谱及质谱条件的优化

通过对黄芩素类化合物的结构进行研究,发现5种黄芩素均含有羟基和羰基,黄芩素类化合物在ESI离子源正负模式电离时,均可以形成[M+H]+和[M-H]-的分子离子峰。因此在电喷雾正、负模式下,以流动注射的方式分别对5种化合物进行质谱扫描,发现5种分析物在正模式下的响应均比其在负模式下高。通过进一步优化射频电压(RF Lens)和碰撞电压,每个目标化合物选取2对响应最强的特征离子作为定性离子,其中响应最高的用于定量分析。

对比了Atlantis T3色谱柱与2种不同品牌的常规C18色谱柱共3种相同规格色谱柱的分离效果。实验结果表明,使用Atlantis T3柱分离,去甲汉黄芩素与黄芩素这两种同分异构体物质的色谱峰部分重合,这是由于它采用三官能团C18烷基键合相,对极性化合物分离有较大优势,但5种黄芩素均为中等极性化合物,因此分离效果不理想;Eclipseplus C18对去甲汉黄芩素和黄芩素两种化合物分离效果不佳;使用Hypersil GOLD柱的分离效果较好,目标物的提取色谱图见图2,其中5种目标物均可达到基线分离。综上,本实验选用Hypersil GOLD柱。

图 4 不同丙酮用量对5种分析物平均回收率的影响(n=6)Fig. 4 Effect of different dosages of acetone on average recoveries of the five analytes (n=6)

图 2 5种目标物在Hypersil GOLD柱上的提取离子流色谱图Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the five analytes on Hypersil GOLD column

2.2 提取条件的优化

2.2.1提取溶剂种类的优化

图 3 不同提取溶剂对5种目标物平均回收率的影响(n=6)Fig. 3 Effect of different extract solvents on average recoveries of the five analytes (n=6)

研究表明,极端pH、加热等条件会令黄酮类物质分解[23,24],黄芩素类化合物属于黄酮类化合物。针对黄芩素类化合物的这类特性,宜采用涡旋振荡的方式进行提取。以下优化实验选取基质效应较低,较具代表性的阴性样品进行加标试验,加标量为200 μg/kg,以阴性样品进行前处理后得到的空白基质液,配制基质标准曲线进行计算。本实验使用5 mL水、20 mL有机溶剂对样品进行提取,5 g氯化钠析出有机溶剂,75 mg C18净化,实验重复6次(n=6)的平均回收率作为参考指标,考察3种不同提取溶剂(乙腈、丙酮和乙酸乙酯)对5种目标物的平均回收率的影响。实验结果如图3所示,对于5种黄芩素,使用丙酮作为溶剂均可获得相对较高的平均回收率。这是因为丙酮极性介于乙酸乙酯及乙腈之间,极性与5种黄芩素相对接近,更适合提取5种黄芩素。综上所述,以丙酮作为本实验提取有机溶剂,能获得最佳提取效果。

2.2.2提取溶剂用量的优化

由于保健品片剂功效成分多,基质复杂,目标物的萃取效率会受到基质中其他组分的影响。此外,提取溶剂用量少,则基质干扰增强;提取溶剂过多,又将影响实验的灵敏度,因此需要对提取溶剂的用量进行优化。本实验对保健品片剂进行加标回收试验,探究5个不同丙酮用量(5、10、15、20、25 mL)对5种分析物平均回收率的影响,因此其他因素固定为5 mL水、5 g氯化钠盐析、75 mg C18吸附剂进行实验,实验重复6次(n=6)。实验结果如图4所示,当丙酮的量为5 mL时,野黄芩素、4′-羟基汉黄芩素、去甲汉黄芩素和汉黄芩素的平均回收率均高于110%,且偏差较大,不利于定量分析。当丙酮用量为10 mL或以上时,5种分析物的平均回收率比较稳定;当提取溶剂量进一步增加,平均回收率呈现下降趋势,其中,野黄芩素、去甲汉黄芩素、黄芩素对条件较敏感,回收率下降幅度较大。这说明在提取过程中,液料比并非越高越好,其原因可能是随着溶剂量的增加其杂质成分溶解性增加,从而导致提取率下降[25,26]。综合考虑,选择使用10 mL丙酮提取。

2.2.3吸附剂种类的优化

本实验对比了PSA、GCB和C18对5种目标物的净化效果,实验重复6次(n=6),采用5 mL水分散基质,10 mL丙酮提取,并加入较少量吸附剂(10、25、50 mg)对类型进行优化,结果表明,GCB对平面结构的5种黄芩素具有很强的吸附力,5种黄芩素在不同用量的情况下回收率为0～2.86%。PSA对黄芩素、去甲汉黄芩素、野黄芩素具有较强吸附,在不同用量的情况下均对3个目标物的完全吸附。这可能是PSA主要作用于黄芩素中的酚羟基,而4′-羟基汉黄芩素及汉黄芩素的C-8位存在甲氧基,甲氧基的供电子共轭效应导致同一苯环上的酚羟基与PSA作用力减弱。但4′-羟基汉黄芩素由于在C-4′位置存在一个独立的酚羟基,因此,PSA对4′-羟基汉黄芩素吸附力较汉黄芩素强。而C18则对目标物基本无吸附作用,C18可以通过非极性作用吸附样品中的淀粉、糖类和脂类杂质,不同用量的吸附剂对5种目标物的回收率见表2。当使用C18作为吸附剂时,对5种分析物均能获得相对较高的回收率。

表 2 3种固相萃取剂用量对5种目标物回收率的影响(n=6)

表 3 不同基质中的基质效应K值

2.2.4吸附剂用量的优化

为了探究5个不同C18吸附剂用量(25、50、75、100和125 mg)对5种目标物平均回收率的影响,本实验以10 mL丙酮为提取溶剂,实验重复6次(n=6)。结果见表2-C18部分。当使用75 mg C18作为吸附剂时,5种分析物均能获得最高回收率;而吸附剂用量多于75 mg时,C18对野黄芩素和黄芩素表现出较强吸附作用,因此回收率迅速降低。综上,本实验选用吸附剂用量为75 mg,经过分析发现,当C18用量大于75 mg时,野黄芩素、去甲汉黄芩素及黄芩素回收率下降幅度较大,对C18吸附剂的用量较敏感。原因可能是:过量的C18吸附剂存在可令这3种黄芩素与C18之间产生瞬间偶极作用,产生吸附。瞬间偶极作用的本质为分子电荷重心的瞬间偏移,C-8位的甲氧基可降低此相互作用,因此4′-羟基汉黄芩素及汉黄芩素在优化范围条件内,较不敏感。

2.3 基质效应的探究

目前市售片剂的主要填料为淀粉、蔗糖、乳糖、预胶化淀粉、纤维素、无机盐等[27],少部分片剂则富含蛋白质。本实验针对以上填料,选取基本包含以上填料的相对较具代表性的海参牡蛎保健片、压片糖果、维生素片等3种保健品片剂基质,探究基质效应的影响。采用1.2.1节的前处理方法,得到空白基质液,配制基质标准曲线,基质标准曲线的斜率与相应浓度标准曲线所得斜率相比,得到比值K。K<0.8表示存在基质抑制现象,K>1.2,表示存在基质增强现象。结果(见表3)显示,不同类型的保健品片剂,由于成分较为复杂,其5种黄芩素的基质效应略有差别。在3种保健品片剂基质中,野黄芩素及黄芩素在质谱分析时,受基质干扰程度较低。K值在0.83～1.19之间。而4′-羟基汉黄芩素、去甲汉黄芩素、汉黄芩素均表现出较强的基质抑制现象及基质增强现象。综合考虑，最终使用基质匹配标准曲线法测定以保证结果的准确性。

2.4 线性关系、相关系数和检出限

实验选取了5种黄芩素呈阴性的压片糖果,经前处理后按照1.2.2节要求配制基质混合标准溶液,在优化后的色谱及质谱条件下进行测定,以各分析物的质量浓度为X,以其相应的质谱峰面积为Y,得到各自的线性方程。结果显示,5种黄芩素在线性范围内呈现出良好的线性关系,相关系数为0.995 4～0.998 0。

取基质混合标准溶液,以1.2.3节及1.2.4节条件进行测定,以3倍信噪比(S/N=3)测定本方法的仪器检出限,结合前处理条件得出方法检出限(LOD)。以10倍信噪比(S/N=10)测定方法定量限(LOQ)。5种分析物的方法检出限为0.5～40.0 μg/kg,定量限为2.0～120.0 μg/kg,结果见表4。由此可见,方法灵敏度较高,可很好地应用于保健品片剂中5种黄芩素的检测。

表 4 压片糖果空白基质中5种目标物的线性关系、检出限和定量限

Y: peak area of quantitative ion;X: mass concentration, μg/L.

2.5 方法的回收率和精密度

选择不含待测目标物的保健品片剂(海参牡蛎保健片、压片糖果、维生素片)进行3水平加标回收试验,添加水平为定量限的1倍、5倍和10倍,每个添加水平日内重复6次,计算得到回收率及精密度。结果如表5所示,回收率在83.1%～106.5%,精密度在0.97%～4.52%。由回收率和精密度可见,该方法可满足日常实验要求。

2.6 实际样品的测定

本实验使用上述所建立的方法,在最优条件下,对购得的3类保健品片剂(海参牡蛎片、压片糖果、维生素片各5个)进行分析检测。15个样品中有2个样品检出黄芩素,分别为38.9 μg/kg及39.7 μg/kg, 8个样品检出汉黄芩素,结果为48.9～2 493.6 μg/kg。野黄芩素、4′-羟基汉黄芩素、去甲汉黄芩素均未检出。阳性样品图见图5。

表 5 5种目标物在样品中的加标回收率及精密度(n=6)

图 5 不同阳性样品的提取离子流图Fig. 5 Extracted ion chromatograms of different positive samples

3 结论

本文建立了分散固相萃取-HPLC-MS/MS同时测定保健品片剂基质中的野黄芩素、4′-羟基汉黄芩素、去甲汉黄芩素、黄芩素和汉黄芩素等5种黄酮类目标物的分析方法。在优化的色谱条件下,5种黄酮类目标物在18 min内完全出峰且峰形良好。优化的分散固相萃取前处理方法对目标物有较好的提取效果。通过对牡蛎片、压片糖果和维生素片的基质效应进行考察,使用不同的基质曲线对测定结果进行校正,并采取方法学实验对方法的可行性进行评估。结果表明,该方法回收率高,灵敏度高,重现性好,适用于保健品片剂中这5种黄酮类化合物的含量测定。